毛细管色谱柱的使用技术及常见故障

1.毛细管的安装
毛细管柱的安装常为人们所忽视,往往会出现作填充色谱柱多年的技术人员,刚使用毛细管柱时,做出的色谱图还不如填充柱的色谱图,这使人们很难理解。但究其原因,多数是由于毛细管柱的安装和操作上的毛病,而不是柱子本身和仪器系统的问题。因此,一根好的毛细管柱和设计得很好的色谱系统,还必须使柱子在系统中安装得合理,才能做出好的结果。
1.1毛细管柱与进样器的连接
对于分流进样,毛细管柱的入口端一定要伸过分流进样器的分流出口(图1A),亦就是使毛细管柱的入口处于载气的高流速区域。如果毛细管柱的入口在流进样器的分流出口以下(图1B),处于载气的低流速区域,得到的色谱图还不如填充柱,所以必须将毛细管的入口伸过分流进样器的分流出口,这样才会得到尖锐的峰形。对于分流/不分流进样,毛细管的入口应接到进样器的底部(图1c),这样可以使汽化管中的样品完全进入柱子,也不会出现气流清洗不到的“死区”。
1.2毛细管柱与检测器的连接在毛细管连接到检测器之前,先接通载气,看一下柱子的出口是否有载气通过,(将柱子出口浸入清水中看是否有气泡出现)如果没有载气从柱子出来,说明柱前的系统中有的地方漏气或柱子堵塞,应找出原因加以解决。然后将柱子的未端尽可能的伸到检测器(FID)的喷嘴以下的1~2厘米处(但不能超过喷嘴如图2 ,并使柱子的出口处于气流的最高流速区域(即氢气引入口以上),如果柱子不能直接伸到检测器的喷嘴下1~2厘米处,但必须伸到尾吹气入口的上部使柱子的未端处于气流的高速区域。图2 毛细管柱与检测器的连接示意图
1.3分流比的测定与选择
分流比可以定义:样品完全汽化时与载气充分混合后,样品通过分流进样器进入柱子的流量FC与通过分流器的流量F分流之比:
  分流比= FC/F分流   (式1)
有的人把分流比定义为:样品进入汽化室后,进样器中总的流速=FC十F 分流与柱
流速FC之比:
  分流比=FC/(FC +F分流)   (式2)
例如,柱子出口流 速为1ml/分,分流器放空的流速为99ml/分,则分流比为100:1 ,因为柱流速FC比分流流速小得多,所以(式1)、(式2)的结果很相近,FC和F 分流可通过皂沫流量计测量。如果载气通过毛细管柱的流量很小,用皂沫流量计不容易测量,FC也可以通过计算求出:
  FC= 60uπr2
其中u为载气的平均线速度,单位厘米/秒。u可以通过进样后用某物质的保留时间求得,某物质可以用甲烷、甲醇等均可,要求是色谱柱对该物质的吸附要小,一般以甲烷为宜,
具体计算方法为:
  u=柱长(厘米)/保留时间(秒)
分流比及分流有大小靠分流阀进行调节,选择适当的分流比也很重要。如果分流比很小,样品大多数进入柱子、容易使峰变宽,形成前伸峰。分流比一般选择在1:100~200之间,这时样品的起始组分的谱带扩展很小,出峰尖锐。对一根0.25mm内径的毛细管柱,用N2作载气,最佳流速0.3~0.4ml/分,则分流流量调到50ml/分左右即可。在毛细管分流进样系统中一般以柱头压力来恒量柱流量的大小,下表给出一些常用的毛细管柱在标准线速度的情况下的柱头压力:
柱内径
柱长度  
0.2mm  
0.25mm  
0.32mm  
0.53mm
15m  0.06Mpa  0.039Mpa  0.024Mpa  0.009Mpa
25m  0.1Mpa  0.065Mpa  0.04Mpa  0.016Mpa
30m  0.13Mpa  0.08Mpa  0.048Mpa  0.019Mpa
50m  0.22Mpa  0.14Mpa  0.08Mpa  0.032Mpa
上表所使用的载气为氮气,线速度为20cm/秒。或氢气,线速度为40cm/秒。1.4尾吹气流量的测量与选择毛细管色谱分析用FID检测器时,一定要加尾吹气,一般用空气或N2气。加尾吹气的作用之一是减少柱后死体积对色谱峰造成的扩散,之二是保证FID有合适的氮氢比。FID系质量型检测器,适当地增加尾吹气可提高检测的灵敏度(图3),但尾吹气太高,会引起基线不稳以至灭火,图3尾吹气流速对峰高的影响尾吹气太低,会引起色谱峰拖尾、对毛细管柱效损失大大。尾吹气流量一般在20-30ml比较适合,可用皂沫流量计来测量。


1.5 毛细管柱的老化
涂渍好的毛细管柱首先要经过充分的老化,以除去固定液中的低分子量物质,一般商品毛细管柱,在制造出厂前都已经过充分老化;但柱子一经从仪器上拆卸下来,较长时间接触空气,在下一次使用之前,最好以较低的初始温度程序升温至最高使用温度老化2—3次。各种固定液因其性质和生产厂家不同而最高使用温度有所不同,所以要注意毛细管柱的说明,生产毛细管柱的厂家应注明最高使用温度。老化中应注意载气的流速不易过大,否则会破坏均匀的液膜。一般非极性柱在250℃
以下老化使用,可用普通氮气,在250℃以上高温使用时,必须使用高纯氮气或普通氮气经脱氧后使用,以延长柱子的使用寿命。对极性柱,尤其是PEG类(聚乙二醇)、FFAP、含氰基的固定液(OV225、?OV275),一定要用高纯氮气(最好高纯氮气经过脱氧,)99.99%否则,固定液很快被氧化,以致不能使用。
1.6交联毛细管柱的清洗
交联毛细管柱最重要的优点是当柱被可溶性有机重组分污时,可以用溶剂清洗除去污染物,使柱得以再生,根据污染的性质,可适用非极性溶剂(如正戊烷)或极性浴剂(如二氯甲烷、丙酮、苯等)。每个试验室都可以做一简单设备,如(图4)来进行清洗。清洗方法:将溶剂装入小瓶的2/3处,把毛细管的出口端(接检测器的一端)刺过青霉素的橡皮盖插入溶剂底部。(青霉橡皮盖较硬,不易被弹性石英毛细管刺透,可用一金属丝或注射针预先刺透,在留的痕迹处插入石英毛细管)。接着用25ml或50ml的注射针,向小瓶内压入空气,溶液即会压入柱内,直全部溶剂从柱中流出,(如果是20米以上的大口径毛细管柱,再加一次溶剂清洗) 随后,将柱从小瓶中拉出与仪器的进样连接,用载气将柱中的溶剂吹干后,再把柱的另一端与检测连接。用程序升温的方式老化l~2次,即可使用。
清洗过程应注意:①溶剂必须用分析纯试剂;②溶剂在柱浸泡时间不能过长,以防止固定液液膜溶涨,使柱效下降。
图4清洗方法示意图
1.25或50ml注射器  2.青霉素小瓶  3.毛细管柱
1.7毛细管色谱分析中常见故障及排除
1.7.1进样不出峰
  这是最常见的问题之一,主要原因有以下凡个方面:漏气:进样隔垫、柱子两端的接头以及放空针形阀前的连接处漏气。火焰熄灭:调节氢气或尾吹气流量的大小,看记录笔是否向一边偏移,如笔不动,说明火熄了或火没点着。
  电路不正常:离子线、放大器、记录仪连线接错或接触不好,放大器有问题。
系统堵塞:在上述情况均正常时应怀疑系统堵塞,样品没有进到检测器,先检查柱后是否有气流通过,如果没有气流通过,可能柱子堵塞,从柱后折断1~2厘米,仍不通气,再检查柱前是否堵塞,在确认柱子通气的情况下,检查柱子到检测器的连接管路是否堵塞。尾吹气没加上:调节尾吹流量,如果记录笔不动(在保证火点着和仪器正常情况下),应怀疑流量不够。关掉氢气和空气,喷嘴口若没有气流,证明是气路堵塞或尾吹管路堵塞。灵敏度太低;可能高压没加上,绝缘不好等仪器本身的问题,也有操作上的原因,高阻太低,衰减大大,记录仪满刻度毫伏数大大等。毛细管色谱常用10 ~10 欧姆的高阻,衰减尽可能小,记录仪满刻度1毫伏(噪音可允许的情况下)。如果记录仪满刻度只有5毫伏或10毫伏,衰减可相应小一些或高阻高一挡。另外,柱子从中间断开。样品浓度大低、放空流量太大。注射针堵塞等原因都可能造成不出峰。
1.7.2色谱峰拖尾,如(图5)
  拖尾峰引起的原因比较复杂,毛细管柱和仪器系统都可能引起拖尾。柱子两端安装不正确,没有超过分流点和尾吹点;或者是安装好后又在接头处断裂;柱外死体积较大;尾吹气流量小,样品在柱内或者系统内壁非线性吸附;汽化室污染,此
时应检查柱子的连接是否正确,有无断裂,尾吹气流量是否合适,强极性组份在金属、载体、固定液和载气以及固定液和玻璃界面上都会发生吸附作用,这些表面吸附作用可以通过表面纯化来解决。最好是将系统全玻璃化,并使用石英毛细管柱,或将样品适当地转化。
  图5拖尾峰和前伸峰前伸峰是由于进样量太大,柱子超负荷,进样器或柱温太低引起的、只要提高仪器的灵敏度,减小进样量,提高进样器温度或柱温,就能或少解决色谱峰的前伸问题。
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