回顾分子生物学的发展历程，PCR技术的发明和普及无疑是最重要的篇章之一。而PCR技术在近20年的不断发展创新中，最受瞩目当属荧光实时定量PCR技术real-timequantitativePCR,orqPCR。定量PCR技术真正实现了PCR从定性到定量的飞跃，通过对PCR过程的实时监控，专一、灵敏快速、可重复地精确定量起始模版浓度，已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用。我公司从荧光定量PCR的原理入手，详细介绍荧光定量PCR仪的类型和技术，为定量PCR仪的选择提供详细参考。
定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。从前面的原理介绍不难看出选择定量PCR仪的关键--由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势--仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管，前者可以一次对多点成像，后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品，需要通过逐个扫描实现多样品检测，对于大量样品来说需要较长的时间。定量PCR仪需要考虑的另外一个因素是软件设计，这一点目前较新型号的仪器都有不错的配套软件可以满足常规使用。--随着定量PCR技术在临床诊断、疾病监控、药物监测、肿瘤研究等领域的越来越广泛的应用，市面上不同品牌和设计的定量PCR仪也不断推陈出新，在这里着重介绍不同的3类定量PCR仪，各有各精彩。
传统的48孔/96孔板式定量PCR仪
传统的48孔/96孔板式定量PCR仪以美国应用生物系统公司ABI为代表。传统48孔/96孔板式定量PCR仪的优点是可容纳的样本量大而且无需特殊耗材，可以采用传统的96孔板或48孔板进行批量的定量反应，但是缺点也显而易见--温度均一性不佳--平板固定加热模块的PCR温度控制有边缘效应--样品槽上每个孔之间的温度存在差异--也就是所谓位置效应，因此标准曲线的反应条件应难以做到与样本完全一致，样本和样本之间的温度控制也可能存在差异，对于灵敏度极高的定量PCR来说，任何极微小的差异都会以指数级别的规模被放大，不能不说是一种缺憾。传统反应板面积大，温度控制的精确性、升降温速度也相对较慢，因而反应速度也较慢。96孔板定量PCR仪的荧光检测分析系统，由于96孔板上样品孔的位置是固定的，每个样品孔距离光源和监测器的光程各不相同，有可能对结果产生影响。检测在试管管底进行，试管底的透光性和厚薄均一性都可能对结果产生影响。MJ和Bio-Red公司以及西安天隆的定量PCR仪也属于这一类。
ABI的7500型荧光定量PCR仪激发光源为卤钨灯光源，5色滤光镜，可同时激发96个样品，超低温CCD具备同时多点多色检测的能力，能够有效地分辨FAM/SYBRGreenI,VIC/JOE,NED/TAMRA/Cy3,ROX/TexasRed,和Cy5等荧光染料。多色荧光检测技术为多重定量、SNP分析、基因型分型和带阳性内对照的阴/阳性分析提供了基础。多重定量即在同一反应管内同时对多个目标基因进行定量，可以大大提高精度并节约成本。随机配置的定量PCR引物和探针设计软件PrimerExpress非常有用，“因为到目前为止还没有其他软件有能力设计定量PCR所需的TaqMan探针摘自ABI技术资料”。各型号都有实时动态Real-Time和终点读板PlateRead两种运行模式。实时动态模式用于定量DNA或RNA拷贝数。可以动态显示PCR扩增曲线的生成，定量的线性范围大于9个数量级，区分5000和10000个拷贝的DNA模板可信度达99.7%。终点读板模式用于基因型鉴定、点突变检测和单核苷酸多态性SNP分析等。当然，也可以作为普通PCR仪使用。ABI定量PCR仪最大的优势在于ABI已经发布十二万种TaqmanGeneExpressionAssays人、大鼠、小鼠基因组基因表达分析试剂盒，覆盖人类全部4万个基因，二百万种TaqmanValidatedSNPGenotypingAssays人、大鼠、小鼠基因组SNP检测试剂盒，为运用7000、7300、7500、7900型开展课题研究创造了绝佳的条件。ABI的定量PCR仪均支持两种定量化学：TaqMan荧光探针和SYBRGreenI荧光染料。其熔解曲线DissociationCurve功能用于判断PCR扩增反应是否特异，有无杂带生成。7500型号比7300多一个滤光镜，新的光路设计使长波长红色荧光的检测灵敏度大大提高，带有快速运行模式。增强的7900型在96孔模块的基础上更加可以更换384孔版模块，使得高通量处理数据的能力大大增强，应该更适合经常处理大量标本的实验室吧。
Bio-Rad伯乐也是大家熟悉的品牌，iCycleriQ实时定量PCR系统也是96孔平板式固定加热的，荧光检测波长范围400-700nm，可4波长同时检测，仪器的设计灵活，定性和定量部分可独立工作，同样可完成梯度PCR。5组滤光片位置使用户可以自由选择不同的检测波长。专利技术intensifier荧光放大器保证了极高的检测灵敏度。MJ的Option系列是在MJ原来的常规PCR仪基础上改造，采用LED光源PMT光电倍增管荧光检测器。96个单色LED光源对应96孔板，但是单色LED激发波长范围窄。Option是单道单个光电倍增管荧光检测器，升级的Option2是双PMT光电倍增管荧光检测器，PMT灵敏度高但一次只能扫描一个样品，所以Option系列是逐孔扫描而非同时检测96个样品。双PMT可同时进行双色检测FAM/SYBRGreenI;VIC/Joe/TAMRA。优势之一是带梯度功能。MJ被Bio-Rad收购后，Option和iCycleriQ目前还是各自走各自的销售渠道，至于将来Bio-Rad会如何决定二者的发展方向还需要拭目以待。
创新概念的离心式实时定量PCR仪
为了克服平板式定量PCR温度均一性差的缺点，聪明的研究人员又开发出创新概念的离心式实时定量PCR仪，以Roche罗氏的Lightcycle和Corbett的Rotor-gene为代表。PCR扩增样品槽被巧妙地设计为离心转子的模样，借助空气加热和转子在腔内旋转，转子上每个孔都是“等位”的，几乎无差别，很好的解决了每个样品孔之间的温度均一性的关键问题--Corbett的Rotor-gene样品间温度差异小于±0.01℃，最大程度地保障了标准曲线和样品之间条件的一致性。利用空气做加热介质的优点在于能实现与反应体系无缝接触，接触面积大且加热均匀。虽然有竞争对手批评空气介质比热小，但事实上Roche的Lightcycle2.0却是目前升温速度最快的定量PCR仪，可以达到20℃/秒!Corbett的Rotor-gene也可以达到5℃/秒样品实际升温速度达到2.5℃/秒，优于多数的平板式PCR仪。借助旋转离心力还可以随时将可能凝在管壁和盖子上的液滴离心到管底而无需热盖;还可以将酶加在管盖上，升温后离心到管底与反应体系混合，实现“机械的热启动功能”。由于升温速度快，对于常规需要2个多小时完成的定量PCR反应，Roche的LightCycler仅需20-30分钟即可完成，可以大大节约时间和提高工作效率。这一点对于研究人员来说极为有用，因为你不再需要等2个多小时才能看实验结果了，或者换句话来说，2个多小时你可以做4-5轮定量实验了。
由于转子上的样品孔是旋转可移动的，因而离心式荧光检测系统可以固定激发光源和荧光检测器，随时检测旋转到跟前的样品管--由于每个样品管在检测时距离检测器和激发光源的距离都是“等价”一样的，使用的是同一个检测器和激发光源，有效减少不必要的系统误差。固定的结构使得仪器运行更稳定，使用寿命更长;离心式定量PCR都是逐个检测样品的，所以大多采用了长寿的LED(发光二极管)冷光源，运行前无须预热，无须校正;系统检测重复性也更好。
离心式定量PCR仪的缺点主要是离心的转子小，能容纳的样本量有限，由于是离心式转子，常规的96孔板和条形管就不适用，有的还需要特殊的消耗品，增加使用成本。当然离心式定量PCR仪不可能带梯度功能。
第三类的荧光定量PCR仪以Cepheid公司的SmartCyclerII为代表，对于国内的用户来说比较新鲜，但这个一直受美国国防部和安全局、美国军队传染病医学研究中心、美国军队士兵和生物化学合作所资助的公司却相当有来头。SmartCyclerII获得过1998年美国研发R&D100金奖。SmartCyclerII的机型小巧，只有16个样品槽，它的独到之处在于这16个样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，也就是说这16个样品槽相当于16台独立的定量PCR仪!独立控温的好处首先是，你可以在同一定量PCR仪上分别进行不同条件的定量PCR反应，更为灵活自定义的梯度优化反应也好，或者是完全不同的几组反应--甚至，你可能只进行个别样品的检测，只占用其中几个样品槽--过一会儿其它的同事也要用--他不需要等待你的反应结束，而可以随时利用空置的样品槽开始其它定量反应!对于各有各忙的多成员的实验室，要是个别样品就占据96孔样品槽，其它人每轮要再等2个多小时，有时还要等几轮，那可够郁闷的。SmartCyclerII的使用频率可以被最大化，大家都不用等待!这个世界上唯一允许不同条件PCR同时进行的定量PCR仪拥有独一无二的优点，是其它任何平板式或者离心式定量PCR都不具备的。
在选购定量PCR前之前我们需要先了解自己的需要--是同时检测大量样本?还是小规模的研究?是固定的标准化检测方法还是有机会尝试不同的方法?随着技术的加速发展不断有新的荧光素、标记方法和试剂盒面市，还要考虑仪器性能在将来的可拓展性等等。了解不同类型的定量PCR仪的特点有助于选择更适合自己需要的仪器，“不求最好，但求适合”。
西安天隆TL988型实时荧光定量PCR仪产品特点
n一体机设计，PCR扩增反应和荧光激发检测一次完成，检测周期大大缩短，且避免了基因扩增到荧光检测使用不同仪器必须转移待测样本而引起污染。完成一个标准两步PCR扩增反应和定量荧光检测只需45～70分钟(因试剂而异)。而定性PCR须3～4小时，酶免终点定量须6～8小时，荧光终点定量须2～3小时。
n应用专利技术实现快速高效均衡扩增检测。由光开关、自聚焦透镜和尾纤准直器及变增益O/E装置组成的MOMENS有机整体，在以16位MCU为核心的电控装置管理下，能在毫秒级时间内完成对全部标本快速均衡扫描检测，避免了机械扫描方式或CCD扫描方式引起的时间之后或渐晕误差，实现高通量实时荧光激发和定量检测。
n采用先进膜加热及半导体热泵制冷技术保证了升降温的快速准确稳定。半导体热电模块技术已经成为当今世界PCR仪的发展主流。
n加有热盖设计保证了无矿物油操作，避免了人为原因造成的污染。
n激发光源采用长寿命LED，终身免维护。
n采用日本原产光电倍增管和美国原产滤光片，保证检测的高灵敏度和高精确度。
n良好的线性范围达100～1010，、灵敏度最小分辨率为1拷贝，重复性CV≤1%。
n样本载台参照0.2ml薄壁PCR离心管设计，通用性好。
n友好简体中文Windows操作界面更符合国人操作，多个标准参数填空式输入和参数输入提示保证了参数输入的有效性。
n每个程序段数多达9个;每个程序的步骤多达9个;每个程序的循环数多达99个，温度、循环等多个参数的多种修正、调节方式，可完全满足临床即科研上试验的要求。
n强大的软件数据管理系统提供完整的病历档案、集成化的网络服务、图表显示、自动试剂及结果跟踪。
n软件在线升级。
n根据用户需要可特别改变检测荧光波长。
n国人设计，关键部件全部采用优质进口原料，性能达到进口原装水平。
n国产仪器的价格，进口仪器的性能。
性能参数
技术原理：标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得CT值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
标本载体：0.2ml薄壁PCR离心管
标本数量：标本数量48个，包括4个标准品
试剂：SYBRGreenI，FAM，TexRed，FITC等荧光染料，开放式PCR试剂
反应体系：10-100μL
建议质控：四个阳性标准品、阴性对照
指标
荧光激发波长：470nm
荧光发射波长：530nm，640nm，710nm;570mm，605mm
荧光检测方式：光开关阵列组合光电倍增管PMT方式
控温范围：4.0℃-99.0℃
热盖温度：100℃～120℃
升/降温速度：≥4.0℃/S(Max)
温度均匀性：≤±0.3℃
温度精确度：≤±0.3℃
温度显示精度：0.1℃
检测范围：101～1010DNA/RNAcopy/ml
CT值重复性误差：CV≤2.1%
核酸精度相关系数：R≥0.997
软件
温阶：1～9
循环：1～99
保温时间：1～9999秒
文件：1～9个连接
升级方式：远程硬件内控软件升级
系统接口：RS-232C串行接口，双向数据
主机操作系统：Windows2000/XP
产品外形尺寸：50cm×40cm×35cm
产品重量：25kg
使用环境：温度5～40℃，相对湿度≤80%
使用电源：AC220×1±10%V,50×1±2%HZ
功耗：1100VA
多规格：提供96孔，多通道/多色、36孔等不同规格产品