几篇综述中已详细的描述了一些定量分析植物，动物和微生物脂质的HPLC方法。最普通和便宜的HPLC分析方法是可见紫外检测器。已经证明可见紫外检测器对具有紫外吸收的脂质有检测效果，但是它对检测脂质提取物中饱和和非饱和物质存在着限制。从20世纪80年代中期开始，第一个用于定量分析脂质的HPLC方法是采用“质量型”检测器，例如离子火焰或蒸发光散射检测器。这些检测器可以检测到饱和和非饱和脂质。第一个利用蒸发光散射检测器检测脂质的方法由W.W.Christie在1985年发表。在1990年，我们小组发表了一个利用离子火焰检测器分析脂质的相似方法，并且我们证明两种检测器是具有可比性的。尽管离子火焰检测器已经成功地用于HPLC方法多年。离子火焰技术很快就被蒸发光散射技术超越。在20世纪90年代中期，离子火焰检测器就被迫停产。在最近的15年里，蒸发光散射检测器的灵敏度得到了很大的提高，已经开发了许多利用HPLC-ELSD检测分析脂质的方法。然而，早期的ELSD检测器对每个物质的最低检测极限为10-20ug，如今ELSD检测器对物质的最低检测极限已经提高至50到100ng。
除了FID和ELSD外，第三种气溶胶类型的检测器被报道也可以应用于脂质的检测。当分离采用微径柱时，此浓缩核激光检测器的最低检测限可小于1ng，但此检测器没有商业化。
最近，一个新型的HPLC“质量型”检测器，电雾式检测器(CAD)，被开发，并且已经商业化。此检测方法包括雾化HPLC柱洗脱液，蒸发流动相溶剂，将气溶胶颗粒带电，测量气溶胶颗粒流产生的电流。最近的一些研究是，利用几种常用的正相和反相定量脂类或脂类分子物质的HPLC分析方法对CAD检测器进行评价。
实验步骤
材料：
所有的有机试剂为HPLC级别，来自BakerAnalyzed，并且是第一次使用。
脂质为色谱级别标准品，无极性脂质MixB和极性脂质Mix来自Matreya。
卵磷脂颗粒(97%大豆磷脂)购自维生素专柜。
大麦脂质提取物用甲烷提取当地的kernels大麦，如以前描述。
液相体系
HPLC体系为Agilent1100型号，并带有自动进样器。
对于需要上样不同浓度的脂质样品时，样品溶液的浓度分别为0.001，0.01，0.1和1mg/ml，每种浓度的样品分别进样1，2，5和10ul，每次平行进样3次。连续采用两种方法进行检测。
电雾式检测器之前，连接有一个Agilent1100型号荧光检测器，此检测器的激发波长为294nm，发射波长为326nm。氮气为电雾式检测器的雾化气体。
CAD检测器其它的所有参数为厂家预先设置。连接荧光检测器和电雾式检测器之间的PEEK管，其长为50cm，直径为0.01mm，管的容积接近25ul。
正相HPLC分析无极性脂质
此检测方法起初是采用蒸发光散射检测器得到的，检测柱子为LiChrosorb7umdiol柱子，采用双梯度流动相，流速恒定为0.5ml/min。
溶液A为99.9%甲烷/0.1%乙酸(所有溶液组成为体积比)。
溶液B为99%甲烷/1%异丙醇。
梯度的时间设置为：0min时，100/0(%A/%B);8min为100：0，10min后为75：25;40min为75：25;41min为100：0;60min为100：0。
通过与商业性标准品的保留时间相对照，确定非极性脂质的组成。
正相HPLC分析极性脂质
极性脂质(包括acylatedsterylglucosides,sterylglucosides和磷脂)的定量分析也与蒸发光散射检测器的方法相似。通过与商业标准品的保留时间相比较，以确定极性脂质的组成。检测柱的类型和流动相的流速与非极性脂质的检测相同。
对于等梯度检测而言，流动相的组成为45.9%的甲烷/50%的异丙醇/4%的水分/0.1%的乙酸。对于梯度洗脱而言，三重梯度包括：溶剂A=99.9%甲烷/0.1%的乙酸，溶剂B=100%的异丙醇，溶剂C=100%水。
梯度时间设置为：0min，90/10/0(%A/%B/%C);30min，58：40：2;40min后，45：50：5;50min，45：50：5;51min，50：50：0;52min，90：10：0;60min，90：10：0。
正相HPLC分析维生素E和tocotrienol。
维生素E和tocotrienol的分析是在以前发布的方法进行改进后进行的。检测柱和流动相的流速同前面方法相同。
三重梯度包括：
溶液A=98%甲烷/2%甲醇t-butylether，溶液B=100%异丙醇。
梯度时间设置为：0min,100：0(%A/%B);40min，100：0;45min，95：5;50min，95：5;51min，100：0;60min，100：0。
质谱被用来辅助进行定性。
维生素E和tocotrienols购自当地的维生素专卖店，其特征峰通过气质连用进行定性。
一Agilent1100型MSD可以在正相模式下进行大气压化学离子化操作(干燥气体流速为6.0L/min，雾化压力为60psi，干燥气体的温度为350度，蒸发室气体温度为325度，施加电压为4000V，冠状电流为4.0uA，电压为80V)。αT(M+1=m/z431.4),αT3(M+1=m/z425.3)，βT和γT(M+1=m/z416.3),δT3和γT3(M+1=m/z411.2)，δT(M+1=m/z402.3)，δT3(M+1=m/z397.1)，其中T为维生素E，T3为tocotrienol。
反相HPLC方法分析脂质分子类似物
此为最新提出的分离triacylglycerols分子类似物和其它非极性脂质的方法。分离柱为PrevailRP183um(150*2.1mm)。三相梯度流动相的恒定流速为0.5Ml/min，溶液A为49.8%甲醇/47%乙晴/3%二氯甲醇/0.2%乙酸，溶解B为100%异丙醇。梯度时间设置为：0min,100:0(%A:%B);20min，95：5;40min,50：50;50min，50：50;51min，100：0;60min,100：0。通过与商业标准品的保留时间相比，已确定非极性脂质的组成。
结果和讨论
用于评价Corona电雾式检测器的第一个HPLC方法是一正相梯度洗脱方法，开发此方法是用来检测分析蔬菜油和甲烷提取物中的主要非极性脂质物质(植物固醇酯,triacylglycerols,游离脂肪酸，游离胆固醇)。
此体系得到的基线相对平稳(图1A)。
一个含有等量的5种非极性脂质(胆固醇：油酸,甘油三油酸酯,油酸,甲基油酸盐和胆固醇)的商业混合物被注入此体系进行检测(图1B和C)。检测器对胆固醇：油酸盐和甘油三油酸酯的响应信号(峰面积)相似，然而对胆固醇和油酸的响应信号分别相对低10%和80%。
CAD没有检测出甲基油酸，很可能是此低分子量的物质应经完全蒸发，没有形成气溶胶颗粒。先前，ELSD检测器也有相似的问题出现。在40度的时候，甲基酯可以部分蒸发，温度升高就全部蒸发。相似的，在ELSD检测器中，游离脂肪酸在40度和60度的时候部分蒸发，在更高的温度下完全蒸发。与ELSD检测器不同的是，CAD检测器的雾化温度是预设的并且不能改变。在此HPLC方法中，CAD检测器的最低检测限是1ng，样品在1ng到20ng的时候，响应信号与样品浓度的比率成线性关系。
第二个评价CAD检测器的HPLC方法是正相定量分析极性脂质，此极性脂质是由极性溶剂提取植物材料得到的(主要是醣脂类和磷脂)。此体系通过等梯度洗脱(图2)和梯度洗脱(图3)两种方法进行评估。
以我们的经验，等梯度洗脱可以有效地分离简单的标准混合物，但是要求梯度洗脱是为了分离多数植物脂质提取物。在等梯度洗脱极性脂质体系中，基线相对的光滑(图2A)。向体系中注射一商业混合物，此混合物含有等量的四种极性脂质(cholesterol,phosphatidylethanolamine,phosphatidylcholine和lyso-phosphatidylcholine)。
四种物质的分离效果明显。在此HPLC体系中，最低检测极限是25ng，样品在25ng到10ug之间的响应信号与样品量呈线性关系(图2C)。由于在原始数据添加标准偏差后，将会使样品量与峰面积的图形很难观察，所以数据的标准偏差在表1中给出。在使用正相梯度检测极性脂质的方法中，35min之前的基线相对比较平滑，在40到55min之间出现增高和峰，然后，在色谱图的剩余部分基线回归到原来的水平。标准样品中的4种极性脂质在梯度洗脱中可以明显地被分离。然后一大豆卵磷脂被注射入检测器，CAD检测器可以检测到相同的主要glycolipids(acylatedsterylglycoside和sterylglucoside)和磷脂(PE，PC，lysoPC和PI),这些物质在利用蒸发光检测器时也可以检测到。
下一个HPLC评价方法是用来分离8种tocopherols和tocotrienols的天然同分异构体。由于tocopherols和tocotrienols具有荧光活性，荧光检测器(在294nm激发和326nm发射)是一选择性非常高的检测器，它可以用来准确定量这些化合物，最低检测极限是1ng。由于CAD检测器的最低检测极限也在1ng左右，我们准备了两份提取物，分别用两种检测器进行对照测试。非常有趣的是，CAD检测器检测到几个比较大的峰，并且这些峰的保留时间与tocopherols和tocotrienols的相似(但是，由于这些峰区域的物质没有荧光性，它们不可能是tocopherols和tocotrienols)。尽管CAD检测器可能用于定量一些tocopherols和tocotrienols,但是存在着其它的具有相似保留时间的峰会使色谱图复杂化。在此情况下，似乎荧光检测器是HPLC方法定量tocopherols和tocotrienols的最好方法。
最后的HPLC分析方法是最近提出的反相分离triacylglycerols和其它极性脂质的方法。与正相分析相比，此方法得到的基线噪声大(图5A)。噪声升高的原因未知。两种商业标准品中的极性脂质用此体系分离，标准品中各组分的量分别为25ng和200ng。由于此体系噪声太大，此体系的最低检测极限为25ng。
在进行前面所提的试验时，我们发现CAD检测器的基线对某些流动相相对光滑，对另外的流动相噪声就比较大。随后，我们设计了一些试验，测量常用的HPLC试剂对CAD检测器基线的影响(图6)，试剂的流速为0.5Ml/min，在没有检测柱和进样的情况下进行试验。HPLC的泵程序设计为进样甲烷10min，然后1min内转化为100%的异丙醇，并保持9min;再以相似的方法转为甲醇，水，和异丙醇最后转至甲烷。第一次试验时，上述四种分析的溶液中，甲醇产生最高的CAD背景噪音(图6A)。第二次试验中，乙晴产生的CAD背景噪音最大(图6B)。甲醇和乙晴是反相液相中最常用的试剂。很明显，需要更多的研究以完全的说明溶液对CAD检测器表现和噪声的影响。
这些最初的结果说明CAD检测器可能成为有效地定量分析脂质的HPLC方法。CAD检测器的最主要优点是它的低检测极限，并且相对于许多类型的脂质，其响应信号与物质的量存在着线性关系。需要长时间的试验以证明此试验结果可以重现，并且此仪器耐用和可靠。