Transwell侵袭实验
1实验用品：
①Transwell小室：
多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boydenchamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。
这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。BD也有已包被好的，价格不清楚。Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。
Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min。sword01战友提供的处理方法：用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×5min，蒸馏水3×5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2。
因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。以前的ChemiconECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次，但现在的膜已经改用一种很薄很脆的材料，一般只能重复用一次，真黑啊!很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的，大家可以试试。
另外，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有专用的膜出售。Transwell小室用过后，可把原来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用过，有兴趣的可以试试。使用方法：trasnwell小室做一次后，将原来的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油(注意用无色较稀的)将osmonic公司的膜贴上，剪掉多余的边缘。再照紫外。
②上层培养液：
上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2%BSA。
③细胞：
值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目进行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要的浪费，一次Transwell侵袭实验花钱少则数百，多则数千，并不是笔小数目，还是小心为妙。另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿12-24h，再进行实验。
④基质胶：
常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国CollaborativeRsearch公司等。CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。同样的东西在sigma叫ECM。如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了。
⑤下层培养液：
下层常用含5%-10%
FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS仍是最合适的。
⑥细胞培养板：
常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。但要注意，细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。
⑦此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin，FN，Sigma有售)，这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原(collagen)或明胶(gelatin)。很多战友认为这不是必须的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试试看。linanping1979战友认为，如果培养时间很长(>24h)，细胞还是会掉到下室里面去，所以有条件的话，最好还是在膜下层涂上FN。另外，值得一提的是，膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。
2.步骤
2.1Transwell小室制备
2.1.1无基质胶Transwell小室制备
①包被基底膜：
用50mg/LMatrigel1：8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen)的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜：
吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel(3.9ug/ul)60-80µl(注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
2.1.2有基质胶的Transwell小室制备
Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300µl预温的无血清培养基，室温下静置15-30min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。
2.2制备细胞悬液
①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。
具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
2.3接种细胞
①取细胞悬液100-200µl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200µl。
②24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
③培养细胞：常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50。用这个浓度处理细胞，24h内对细胞增殖并无明显抑制，但24h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。
时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。
另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象。在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1-2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
第三节Transwell的其他应用的实验步骤
1.Transwell肿瘤细胞迁移实验
过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。
2.cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步骤
做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请大家共同探讨：
(1)将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1%胰蛋白酶XIV(Sigma)，100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素(Gibco-BRL)、无Ca2+、Mg2+，无血清的MEM。
(2)用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。
(3)离心后立即用新鲜的上述MEM溶液(含10%胎牛血清)清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的LHC-8medium(Biofluids)冲洗一次。
(4)冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90%，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上(12mmSNAPWELL，Costar)，以37°C5%CO2-95%空气含5%胎牛血清(Gibco-BRL)and100U/ml青霉素and100ug/ml链霉素的LHC-8medium孵育6～10天。
(5)孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验。
显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片
3.metastasis战友的TranswellB16细胞的体外迁移实验
我以前用costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜(0.8um)的下表面涂一层fibronectin(10ug/ml，50ul)，37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基(含10%血清)的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞(100ul，用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度)，放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。
4.mci战友的内皮细胞HMEC-1迁移实验
1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100µl用serum-freeMCDB131稀释的5×104/孔的HMEC及不同浓度的药物，下室加入0.6mlserum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移，同时设置相应阴性及阳性对照，置于CO2培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜(Olympus，DP50，Japan)。下观察并拍照，最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟，于600nm处测定OD值。抑制率计算公式为：抑制率(%)=【(OD值给药组-OD值无刺激阴性对照)/(OD值不加药阳性对照-OD值无刺激阴性对照)】×100%。