一、试剂准备
1、新鲜配制冷的RIPA裂解缓冲液:
150mMNaCL
1%NP-40(去垢剂)
0.1%SDS(去垢剂)
2ug/mlAprotinin(蛋白酶抑制剂)(使用前加入)
2ug/mlLeupeptin(蛋白酶抑制剂)(使用前加入)
1mMPMSF(蛋白酶抑制剂)
1.5mMEDTA(蛋白酶抑制剂)
1mMNaVanadate(磷酸脂酶抑制剂)(任选)
以上所有试剂均按比例溶于150mMNaCL溶液中。
2、冷的PBS中加入1mMPMSF
1.5mMEDTA
1mMNaVanadate(钒酸钠)(任选)
3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶(90%以上生长面积)。
二、实验步骤
1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上，用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS，重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。
2、向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液(每75cm2培养瓶加1ml).然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮(由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。
3、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml离心管中(置于冰上)，然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。
4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。
5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度(用BioradBradford试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定)，分装保存在-70℃。