HRM(HighResolutionMelt)，中文译为“高分辨率熔解”是近几年来在国外兴起的最新的SNP及突变研究工具。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析。这种方法因其操作简便、快速，使用成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。
HRM高分辨率熔解曲线示意图。
不同的基因型表现为不同的HRM熔解曲线形状
HRM与常规熔解曲线的区别：
HRM虽然是SNP及突变研究领域中最新的研究手段，但HRM的概念其实早在上世纪70年代就已经提出并应用于相关的研究中1，2，3。当时人们已经提出，并通过实验证明，熔解曲线的变化可以反映核酸性质的差异。限于当时有限的实验手段，人们通过紫外吸收来绘制熔解曲线，当然这种方法在检测精度上相比现在的研究手段要大打折扣。但人们并未因此而放弃熔解曲线这一分析手段，随着仪器的改良和定量PCR技术的出现，人们开始用SybrGreenI荧光染料在在定量PCR仪上监测熔解曲线的变化，这也是现今使用最多的熔解曲线研究工具。然而限于分辨率的关系，SybrGreenI熔解曲线一般用于区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列，例如用于检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其它非特异性的扩增。如果要用SybrGreenI熔解曲线来区分SNP，目前看来是无法实现的，这与该类染料的特性相关。像SybrGreenI这类染料属于非饱和性染料，由于染料对PCR的抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远低于将DNA双螺旋结构中的小沟饱和的浓度，由于使用浓度未达到饱和，加之染料本身的特性，在DNA双链解链的过程中，SybrGreenI分子发生重排，那些从已经解链的DNA片段上脱离下来的染料分子又与尚未解链的双链DNA结合，造成结果失真，无法真实反映DNA熔解的情况，影响了检测的分辨率。近几年来，人们发现/发明了一类新型的染料，称为饱和染料，目前商业化的饱和染料有LCGreen，LCGreenPlus，SYTO9和EvaGreen。这类染料有着更强的DNA结合能力和很低的抑制作用，在DNA解链过程中不会发生重排，这使得用这些染料的熔解曲线有了更高的分辨率。在仪器精密度提高的基础上，配合这类饱和染料就出现了我们现在所说的高分辨率熔解曲线，即HRM。这样人们便可以利用熔解曲线分析这种极其简单的实验手段来对SNP和突变进行研究了。
非饱和染料
(饱和染料)
SNP相关研究方法比较：
目前突变/SNP的研究手段大致有三大类，一类是以荧光共振能量传递为基础的检测方法，简单的说就是以定量PCR为基础的，比如我们很熟悉的Taqman探针法，以及经常提到的分子信标(Molecularbeacon)和FRET(HybProbe)，应用这一类方法时需要我们对突变位点或是多态性位点的背景很清楚，针对特定的突变位点或多态性位点设计并合成序列/位点特异性探针。第二类是以分子杂交技术为基础的检测方法，如寡核苷酸连接分析(OLA)和动态等位基因特异性杂交(DASH)，这几种方法也均涉及到序列特异性探针。第三类是基于PCR技术与其它方法相结合的检测方法，如变性-高效液相色谱(DHPLC)、SSCP(单链构象多态性)、DGGE(变性梯度凝胶电泳)，这几种方法在PCR扩增的基础上对产物过柱分析，或电泳分析，无需合成序列特异性探针;第三类方法中还包括测序、Pyrosequencing和Ecotilling等技术。此外还有芯片等技术可用于SNP分析。第一类方法中最常用的技术为Taqman探针法，用于对特定位点SNP的检测，其显著特点是速度快，通量大。第二类方法由于方法的可操作性及其它一些原因，一直没有得到普遍的应用。第三类方法的显著特点是不受位点的局限，可对已知和未知突变/SNP进行操作，但DHPLC仪器昂贵，使用成本高，SSCP和DGGE通量相对较小、操作繁琐、成本高、速度慢;测序是所有突变/SNP检测的金标准，但测序的成本相当可观;Pyrosequencing技术的突出优势在于Pooling，特别适用于大规模的等位基因频率分析，但需要特殊的仪器，硬件成本高;Ecotilling是一种在目标区段内筛查SNP的高通量、低成本的方法，但由于需要合成特定的红外引物，所以在样本量少、研究区段多的情况下就无法体现其优势。芯片技术可对样本在全基因组范围内进行SNP扫描，但由于使用成本昂贵，不适用于对大量样本的分析。从以上几类方法的特点可以看出，相对使用成本较低、通量较大的方法大都局限于已知、特定位点，可如果既要对已知位点分析又要查找未知位点，那么相对的方法较少，且成本高或操作繁复。而HRM之所以这么多年来一直为人们孜孜以求，也是基于这一原因，它是一种低成本、高通量、快速，且不受位点局限的检测方法。
HRM对硬件的要求：
高分辨率熔解曲线(HRM)源于熔解曲线，原理完全一致，在实验设计上也很相似，所不同的是熔解曲线的升温速率和所用的染料。由于HRM的目的是能够对于单碱基差异进行区分，所以对温度分辨率的要求相当高。虽然二者都是一个逐步升温的过程，但每一步升高多少温度就决定了它是否可以称为高分辨率。常规熔解曲线升温时每步升高1℃，而高分辨率熔解曲线每步升温0.02-0.1℃，如此才能满足对单碱基差异的区分。另外，作为一种高通量的研究方法，同时需要比较多个样品，因此样品之间控温的均一性同样会影响结果的判定。两孔之间如果温度相差0.1℃就很可能导致最终的熔解温度相差0.1℃，那就无法保证HRM分析结果的准确性，造成偏差，因此HRM对仪器温度的均一性要求同样比较高。大多数常规的定量PCR仪，一般的孔间温差都在0.3-0.5℃，这是常规定量PCR仪无法胜任HRM的主要原因之一，因此，除了温度分辨率之外，温度的均一性也是硬件方面一个很重要的指示。另外，除了对每步升温幅度的控制及温度均一性的要求之外，对光源也有一定的要求，HRM对光源强度的要求更高，以提高检测的灵敏度与分辨率。