微生物法
1.原理
维生素B6在酸性介质中对热比较稳定，但在碱性介质中对热不稳定。测量维生素B6比较经典的方法是"微生物法"它的优点是：1.特异性高、精密度好、操作简单(不需要特殊设备，易于推广，样品不需要进行一系列的提纯步骤)、准确度高。它的缺点是：耗时长、必须经常保存菌种、试剂较贵。
2.适用范围
GB/T17407-1998，适用于药物、食物及饲料的检测
3.仪器
电热恒温培养箱
电热手提式压力蒸汽消毒器
液体快速混合器
离心机
722光栅分光光度计
硬质玻璃试管
4.试剂
(1)0.22mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入12.32mlH2SO4，用水稀释至1000ml。
(2)0.5mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入28mlH2SO4，用水稀释至1000ml。
(3)10mol/L氢氧化钠：溶200gNaOH于水中，稀释至500ml。
(4)0.1mol/L氢氧化钠：取10ml10mol/LNaOH，用水稀释至1000ml。
(5)溴甲酚绿：0.04%溶液，称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释到250ml。
(6)培养基：称取吡哆醇Y培养基5.3g，溶解于100ml蒸馏水中。
(7)100ug/ml吡哆醇标准储备液：称取122mg盐酸吡哆醇标准溶于1L25%乙醇中，保存于4℃冰箱中，稳定1个月。
(8)1ug/ml吡哆醇标准中间液：，取1ml吡哆醇标准储备液，稀释至100ml。
(9)琼脂培养基：吡哆醇Y培养基5.3g，琼脂1.2g，稀释至100ml。
(10)1.5MOL/l生理盐水：取9gNaCl溶于1000ml水中。
5.菌种的制备与保存
5.1储备菌种的制备与保存：以卡尔斯伯酵母菌SaccharomycesCarlsbergensisATCCNo.9080简称SC?纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在30±0.5℃恒温箱中培养18-20小时，取出后置于冰箱中保存，至多不超过两星期。保存两周以上的菌种，不能立即用作制备接种用的种子液，一定要在使用前每天移种一次，连续2~3天，方可使用，否则生长不好。
5.2种子培养液的制备：加0.5ml50ng/ml的VB6标准应用液于尖管中，加入5ml基本培养基，塞好棉塞，于压力蒸汽消毒器内(高压锅)151b压力下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保留数星期之久。
6.操作步骤
整个步骤要避光
(1)样品制备：取样0.5~10g(VB6含量不超过10ng)放入100ml三角瓶中，加0.22mol/LH2SO472ml。放入高压蒸汽锅121℃下水解5个小时，取出，于水中冷却，用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4调PH值至4.5，用溴甲酚绿做指示剂。(指示剂由黄-黄绿色)，将三角瓶内的溶液转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，滤纸过滤，保存滤液即样液于冰箱内备测定(保存期不超过36小时)。
(2)接种液的制备：使用前一天，将卡尔斯伯酵母菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时接种两管，在30±0.5℃的恒温箱中培养18-20小时。取出离心10分钟(3000rpm)倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10ml消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。3.样品标准曲线的测定：取标准储备液2ml稀释至200ml成为中间液，从中间液中取5ml稀释至100ml作为工作液，浓度为50ng/ml，3组试管各加0，0.02，0.04，0.08，0.12，和0.16ml工作液，再加5ml吡哆醇Y培养基，混匀，加棉塞。
(3)试样的测定：在试管中分别加入0.05，0.10，0.20ml样液，再加入5ml吡哆醇Y培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅(121℃，15磅/英寸2)高压10min，冷至室温备用。
(4)接种和培养：每管接种一滴接种液，于30±0.5℃恒温箱中培养18-22小时
(5)测定：从恒温箱中取出后，用722分光光度计测量，用空白管调零。550nm波长下，测定各管的吸光度值，以标准管所含VB6的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制VB6标准工作曲线，用测定管得到的吸光度值，在标准曲线上查到测定管内所含VB6的量。
7.计算
各样管的吡哆醇含量A为：
A(ng/ml)=(x1/V1+x2/V2+x3/V3)/3
则样品的吡哆醇含量为：
mg/100g=A×V×102/w×106=A×V/W×104
每个样品各测定管的吡哆醇含量为x1，x2，x3;
取液量分别为V1，V2，V3
样品重W(g)取液量V(ml)，
定容至100ml
8.注意事项
(1)所有步骤需要避光处理
(2)培养时每管必须在同一温度，培养时间以18-24hour为宜。
(3)本实验所有用水皆采用蒸馏水。
食物中维生素B6的测定方法