此处介绍蔬菜中维生素K1的测定方法(HPLC法)和食物及饲料中水溶性维生素K3(甲萘醌)的测定方法
一、蔬菜中维生素K1的测定方法-HPLC法
1.原理
蔬菜中的维生素K1经有机溶剂提取后，经失活的磷酸盐处理过的氧化铝色谱柱进行净化，再用液相色谱法将维生素K1分离并进行定性定量测定。
2.适用范围
本标准适用于各类蔬菜、绿色植物及其干制品中维生素K1的测定。
3.仪器：
(1)实验室常用设备
(2)打碎机
(3)202-R型恒温干燥箱
(4)色谱柱：为0.8cm×30cm的玻璃柱，底端收缩变细，并装有活塞，活塞上约1cm处有一玻璃筛板，筛板孔径为16～30μm，柱上端膨大为容积约30ml的储液池。使用前需干燥
(5)旋转蒸发器
与旋转蒸发器配套的旋转蒸发瓶：具塞，圆底，容积为150ml。
(6)恒温水浴锅
(7)高纯氮气
(8)高速离心机
与高速离心机配套的小离心管：具塞，容积为1.5～3.0ml。
(9)紫外分光光度计
(10)HPLC：高效液相色谱仪，带紫外检测器
4.试剂
除特殊说明实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯，有机溶剂使用前需重新蒸馏。
3.1无水硫酸钠：使用前需在150℃的烘箱内烘烤4～8小时，以去除水分。
3.20.14mol/LNa2SO4溶液：称取20g无水硫酸钠，用蒸馏水溶解后定容至1L。
3.3丙酮：分析纯。
3.4石油醚：沸程30～60℃，分析纯。
3.50.6mol/L碘化钾溶液：称取10g碘化钾，用蒸馏水溶解定容至100ml。
3.65g/L淀粉液：称取0.5g可溶性淀粉，用水溶解定容至100ml。
3.7乙醚：分析纯。不含过氧化物。
(1)过氧化物的检查方法：用5ml乙醚加1ml0.6mol/L碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色。或加4滴5g/L淀粉液，水层呈蓝色。则该乙醚含有过氧化物需处理后使用。
(2)去除过氧化物的方法：重蒸时瓶中加一段纯铁丝，弃去10%初馏液和10%残留液。
3.8洗脱液：石油醚+乙醚(97+3)。
3.9甲醇：优级纯。
3.10正己烷：优级纯。
3.11磷酸氢二钠：分析纯。
3.12中性氧化铝：100～200目。
3.13氧化铝的处理：
(1)磷酸盐处理氧化铝：取250g中性氧化铝，20g磷酸氢二钠，1.6L蒸馏水，放入容积为2L的锥形瓶中沸水浴30min，不时摇动或搅拌。冷却，倒掉上层液体(包括悬浮的细小颗粒)，然后用布氏漏斗抽滤。将残留物转至平底玻璃皿中，于150℃干燥箱中烘烤3～5h至两次称量相差3g以下，烘烤过程中不时搅拌，以避免结块，冷却后放入干燥器中保存。
(2)失活处理氧化铝：使用前，将磷酸盐处理的氧化铝，加入具塞锥形瓶中。每100g氧化铝加9.0ml去离子水，盖紧瓶塞，蒸汽浴或80℃干燥箱加热3～5min，剧烈摇动锥形瓶，使氧化铝可以自由流动，无结块。冷却，静置30分钟，使水分分布均匀。
(3)验证处理过的氧化铝：取标准应用液1.0ml，用氮气吹干，再用石油醚溶解定容至1.0ml。然后按5.3装柱，将标准溶液加入柱上，按5.4净化步骤进行柱色谱，用旋转蒸发瓶收集洗脱流出液，浓缩，氮气吹干，用正己烷定容至1.0ml，HPLC测定，记录峰面积或峰高(A)。另取标准应用液直接测定，记录峰面积或峰高(Ar)。将A与Ar进行比较，其值在0.97～1.03之间(A/Ar)，则说明柱效较好，氧化铝处理合格。否则需重新进行失活处理。如果再次验证比值仍不能达到0.97，则需重新制备氧化铝。
3.14维生素K1标准：Sigma公司，纯度>98%。
3.15标准贮备液：精确称取50.0mg维生素K1标准，用正己烷溶解定容至50.0ml，即1.0mg/ml。将储备液分装成安瓿，冷冻保存。
3.16标准工作液：取标准贮备液，用正己烷准确稀释50倍,即20.0μg/ml。
标准工作液的标定：取标准应用液测定紫外吸光值，波长248nm，比色杯厚度1cm，以正己烷为空白，测定3次，取平均值，按下式计算标准应用液浓度。X1=A×M×103……………………………………(1)
E
式中：X1--维生素K1标准应用液浓度，μg/ml;
A--标准应用液平均紫外吸光值;
E--摩尔消光系数，20,000;
M--维生素K1分子量450.7;
103--换算成μg/ml的换算系数。
5.操作步骤
所有操作均需避光进行
5.1样品处理
(1)新鲜蔬菜：拣净去杂物，将可食部洗净，擦去表面水分，切碎，用打碎机制备成匀浆。
(2)干制植物性样品：磨碎,过60目筛。
5.2样品提取
(1)称取已打成匀浆的新鲜样品2～10g(维生素K1含量不低于2μg)，加到具塞锥形瓶中,再加入5～10倍体积的丙酮,盖上塞子,振摇3～5min，静置1min，以下按5.3步骤操作。
(2)称取干制植物性样品0.2～4g(维生素K1含量不低于2μg),加到研钵中，再加入2～4倍于样品量的无水Na2SO4研磨均匀后,加入25ml丙酮,研磨3～5min，静置1min。
(注：对于细胞壁比较厚的样品，如藻类食品，可先用石英砂研磨，破坏植物组织细胞。石英砂需进行预处理，将石英砂用20目筛子过筛之后，先用浓盐酸浸泡，然后再用稀氢氧化铵浸泡，最后用蒸馏水洗至中性后在烘箱中烤干。使用时，每10g样品加3～5g石英砂于研钵中研磨。)
5.3洗涤
将上部澄清液倒入已装有50～100ml0.14mol/LNa2SO4溶液的分液漏斗中，残渣再用丙酮提取2～3次，每次用量不少于25ml，上清液并入分液漏斗。残渣继续用石油醚洗涤3～4次，每次用量约25ml，至洗涤液呈无色，将洗涤液倒入同一分液漏斗中，振摇1min，静置。弃水相，有机相用蒸馏水洗涤4～5遍，至水相澄清。弃水相，将有机相经无水Na2SO4脱水后转至旋转蒸发瓶中，于60℃水浴中减压蒸馏至约2ml时取下，立即用氮气吹干，用石油醚定容至2.0ml，待净化。
5.4装柱
取干燥色谱柱，将验证好的氧化铝浸泡于石油醚中，湿法填充于色谱柱，使氧化铝自由均匀流下，至柱高为20cm，其上端再加2cm无水Na2SO4。打开活塞，调整流速为每秒1滴。一根色谱柱只用于一个样品测定。
5.5色谱净化：待石油醚流至柱上端0.5cm时，加V1ml样品提取液，当样品液流至柱平齐时，加2ml石油醚冲洗柱壁，流下。再加10ml石油醚洗脱，2次，弃除流出液。然后，用30ml洗脱液洗脱，用旋转蒸发瓶收集流出液。流出液于旋转蒸发器浓缩近干，取下用氮气吹干后，用正己烷定容为V2ml。将定容液移入小塑料离心管中，5000rpm离心5min，上清液供HPLC分析。
5.6标准工作曲线的绘制
分别取维生素K1标准应用液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml，加入分液漏斗中，按5.2步骤提取，浓缩定容至2.0ml。取1.0ml标准提取液按5.4步骤操作，最后定容至1.0ml，即标准工作曲线中各点维生素K1含量分别相当于5，10，20，40，60，80，100μg/ml。然后再按5.6条件进行HPLC测定，记录峰面积或峰高。以标准含量为横坐标，峰面积或峰高为纵坐标绘制标准工作曲线。
5.7HPLC色谱分析
色谱条件(推荐条件)：
预柱ultrapackODS，10μm，4.0mm×4.5cm。
分析柱：ultrasphereODS，C18，5μm，4.6mm×250mm。
流动相：甲醇+正己烷(98+2)。混匀，临用前脱气。
进样量：20μl。
流速1.5ml/min。
紫外检测器：波长248nm。量程0.01～0.05。
HPLC稳定性的测定：取标准应用液连续进行6次HPLC测定，计算峰面积或峰高的平均值、标准差和RSD%，如果RSD