高效液相色谱法
1.原理
样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离，以石油醚萃取后，用正相色谱柱提取富集，用反相色谱柱，紫外检测器定量测定。
2.适用范围
本方法来源于GB/T5413.9-1997。适用于婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、维生素D、维生素E的测定;也适用于食品或强经食品及饲料中的维生素D含量的测定。
3.主要仪器
1)高压液相色谱仪，具有可变波长的紫外检测器，数据处理系统或记录仪。
2)旋转蒸发器。
3)平底烧瓶：250mL。
4)分液漏斗：500mL。
4.试剂
所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所实验用水均指蒸馏水。
1)异丙醇：色谱纯。
2)2%焦性没食子酸乙醇溶液：取2g焦性没食子酸溶液于100mL无水乙醇中。
3)75%氢氧化钾溶液：取75g氢氧化钾溶于100mL水中。
4)石油醚：沸程30～60℃。
5)甲醇：色谱纯。
6)正己烷：色谱纯。
7)环己烷:色谱醇。
8)维生素D标准溶液
A.维生素D2标准贮备液：含维生素D2100mg/ml的甲醇溶液。称取10mg的维生素D2，用甲醇定容于100mL容量瓶中。
B.维生素D3的标准贮备液：含维生素D3100mg/ml的甲醇溶液。称取10mg的维生素D3，用甲醇定容于100mL容量瓶中。
5.操作步骤
5.1样品处理：准确称取10g样品，于250mL平底烧瓶中，加30mL蒸馏水。
5.2测定液的制备：
1)于上述样品溶液中加入100mL的20%没食子酸乙醇溶液，充分混匀后加50mL75%氢氧化钾溶液，在蒸汽浴上边续回流30min后，立刻冷却到室温。
2)将皂化液转入一500mL分液漏斗中，用100mL水分几次冲平底烧瓶。洗涤液并入分液漏斗中。
3)于上述分液漏斗中，加入100mL石油醚，盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇1min.在振摇过程中，注意释放瓶内压力。静置分层，将水相放入另一500mL分液漏斗中，重复上棕萃取过程2次，合并醚液到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在40℃和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近于(绝不允许蒸干)后，用石油醚转移至10mL容量瓶中，定容。
4)从上述容量瓶中取7mL放入一试管中，用氮气将石油醚吹干，于试管中加1mL正己烷。
5.3测定：
1)测定液的制备：
A)仪器条件：
色谱柱：30cm×40cm，硅胶柱。
流动相：正己烷与环己烷按体积比1：1混合，并按体积分数0.8%加入异丙醇。
流速：1mL/min。
波长：265nm。
柱温：20℃。
灵敏度：0.005AU/MV。
注射体积：200mL。
B)注射50mL维生素D标样和200mL样品溶液，根据维生素D标样保留时间收集维生素D于试管中，将试管用氮气吹干，准确加入0.2mL甲醇溶解。
2)测定步骤：
A)仪器条件：
色谱柱：4.6mm×25cm，C18或具同等性能的色谱柱。
流动相：甲醇。
流速：1mL/min。
波长：265nm。
柱温：20℃。
灵敏度：0.005AU/MV。
注射体积：50mL。
B)注射50mL维生素D标准溶液，注射50mL样品溶液，得到标样和样品溶液中维生素D峰面积或峰高。
6.计算
ρs×10∕7×40×100
X=
m
As
ρs=---×ρsd
Asd
式中：X--样品维生素D的量，mg/100g;
m--称样量，含量，IU∕100g;
ρs--进样液中维生素D有浓度，mg/mL;
As--进样液中维生素D有峰高(或峰面积);
Asd--标样液中维生素D有峰高(或峰面积);
ρsd--标样中维生素D的浓度;
计算结果精确至小数点后一位。
7.注意事项
1)允许误差及最小检出量：同一样品的2次测定值之差不得超过2次测定平均值的10%;最小检出量为0.1国标单位。
2)试剂焦性没食子酸容易变性，应购习近期生产的试剂。
3)如果皂化不完全，可适当增加氢氧化钾的加入量。
维生素D的测定方法