1.分光光度法定义与应用
1.1定义:分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术.
1.2特点:灵敏,精确,快速和简便,在复杂组分系统中,不需要分离,即能检测出其中所含的极少量物质.
1.3应用:生物化学研究中广泛使用的方法之一,广泛用于糖,蛋白质,核酸,酶等的快速定量检测.
2.分光光度计的基本结构和工作原理
2.1分光光度计的分类
2.2分光光度计工作原理
2.3分光光度计的基本结构
2.4分光光度法的测量误差
2.5显色反应及其影响因素
2.1分光光度计的分类
分光光度计的分类
红外分光光度计:测定波长范围为大于760nm的红外光区
可见光分光光度计:测定波长范围为400~760nm的可见光区
紫外分光光度计:测定波长范围为200～400nm的紫外光区
2.2分光光度计工作原理
人眼可见的光只占电磁波谱的很小—部分(400~760nm)
它是一种频率较大的电磁波.电磁波按频率大小,从频率最小的无线电波到频率最大的γ-射线排成一列,即组成电磁波的波谱,
2.2.1分光光度计的光谱范围
包括波长范围为400~760nm的可见光区和波长范围为200～400nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源.
钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400～760nm波长的光谱,光通过三棱镜折射后,可得到由红,橙,黄,绿,蓝,靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源.
氢灯的发射光谱:氢灯能发出185～400nm波长的光谱,可作为紫外光光度计的光源.
2.2.2物质的吸收光谱(1)
如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱,它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失,这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱.
不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.
2.2.2物质的吸收光谱(2)
当光线通过某种物质的溶液时,透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收,只有一部分光可透过溶液.
入射光=反射光+分散光+吸收光+透过光
如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的损失,则:
入射光=吸收光十透过光
2.2.3物质吸光度(A)与透射比(T)的关系
设I0为经过空白校正后入射光的强度;I为透过光的强度.
根据实验得知I=I0?10-εcl
式中,c表示吸收物质的摩尔浓度;l表示吸收物质的光径,用cm表示;ε表示吸收物质的摩尔消光系数,它表示物质对光的吸收特性,不同物质的ε数值不同.所以I/I0=10-εcl
令T(透射比)=I/I0T=10-εcl
若以T对吸收物质的浓度作图,则得图1-5-2中的曲线.
由上式可得1g(1/T)=εcl
lg(l/T)为物质的吸光度(A)A=1g(1/T)
2.2.4Lambert-Beer定律(E=εcl)
上式说明了物质的吸光度与吸收物质的浓度和液层的厚度成正比,这就是光吸收的基本定律--Lambert-Beer(朗伯-比耳)定律.
2.3分光光度计的基本结构
无论哪一类分光光度计都包括:光源,单色器,吸收池,检测器和测量仪表.分光光度计各部件的次序如图所示:
5个基本部件
分光光度计的基本部件(1):
光源:分光光度计上常用的光源有两种:钨丝灯或氢灯,在可见光区,近紫外光区和近红外光区常用钨丝灯作为光源;在紫外光区多使用氢弧灯.
单色器:把混合光波分解为单—波长光的装置.在分光光度计中多用作为色散元件.
吸收池比色杯,比色皿,比色池)一般由玻璃,石英或熔凝石英制成,用来盛被测的溶液.在低于350nm的紫外光区工作时,必须采用石英池或熔凝石英池.
分光光度计的基本部件(2):
吸收池(比色皿)必须与光束方向垂直.此外,每套比色皿的质料,厚度应完全相同,以免产生误差.比色皿上的指纹,油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性,因此在使用前务必彻底清洗.
常用光电池,光电管和光电倍增管三种.
测量装置—般常用的紫外光和可见光分光光度计有3种测量装置,即电流表,记录器和数字示值读数单元.现代的仪器常附有自动记录器,可自动描出吸收曲线.
检测器
棱镜与光栅
棱镜:光波通过棱镜时,不同波长的光折射率不同;因而能将不同波长的光分开.玻璃对紫外线的吸收力强,故玻璃棱镜多用于可见光分光光度计.石英棱镜可在整个紫外光区传播光,故在紫外光分光光度计中广为应用.
衍射光栅:在石英或玻璃表面上刻划许多平行线(每英寸约刻15000—30000条).由于刻线处不透光,通过光的干涉和衍射使较长的光波偏折角度大,较短的光波偏折角度小,因而形成光谱.
棱镜单色器装置示意图
光源照到棱镜(或光栅)以前,先要经过一个入射狭缝,再通过平行光镜使成为平行光束投到棱镜上.透过棱镜的光再经另一聚光镜,在此聚光镜的焦面内可得一清楚的光谱图.如在焦线处放—出射狭缝,转动棱镜使光谱移动,就可以从出射狭缝射出所需要的单色光.整个装置称为"单色器"
检测器---光电池
光电池装在一个特制的匣子里面由3层物质组成的圆形或长方形薄片.第一层是一种导电性良好的金属,这是光电池的负极.中间极薄的一层是半导体硒,第3层是铁,这是光电池的正极.当光电池受光照射以后,半导体硒的表面逸出电子,这些电子只向负极方向移动,而不向正极移动,因此在上下两金属片间产生一个电位差,线路连通时即产生电流
检测器---光电管
光电管光电管是由封装在真空透明封套里的一个半圆柱型阴极和一个丝阳极组成.阴极的凹画上有一层光电发射材料,此种物质经光照射可发射电子.当在两极间加有电位时,发射出来的电子就流向丝阳极而产生光电流.对于相同的辐射强度,它所产生的电流约为光电池所产生电流的1/4.由于光电管具有很高的电阻,所以产生的电流容易放大.
检测器---光电倍增管
光电倍增管它比普通的光电管优越,它可将第一次发射出的电子数目放大到数百万倍.当电子打在兼性阳极上时,能引起更多的电子自表面射出.这些射出的电子又被第二个兼性阳极所吸引,同样再产生更多的电子.
此过程重复9次后,每个光子可形成106~107个电子.这些电子最后被收集在阳极上.所得到的倍增电流可进一步加以放大和测量.
2.4分光光度法的测量误差
分光光度法的测量误差
选择适宜波长的入射光
控制吸光度A的遍数范围
选择适当的参比溶液
仪器测
量误差
测量条
件选择
2.4.1仪器测量误差
由朗伯-比尔定律可知,只有在一定的浓度范围内,即一定的吸光度范围同内,由分光光度计测量所引起的测定结果的相对误差才是较小的;当透光率接近0或1.0时,其相对误差趋于无限大;一般在百分透光率在10~80%的范围内(即吸光度在1~0.1),浓度测量相对误差较小;对于精密度高的仪器.当吸度A=0.7-0.2时(百分透光率约为20-60%,测量误差约为1%.
2.4.2测量条件选择
(1)选择适宜波长的入射光:由于有色物质对光有选择性吸收,为了使测定结果有较高的灵敏度,必须选择溶液最大吸收波长的入射光.
(2)控制吸光度A的准确的读数范围:由朗伯-比耳定律可知,吸光度只有控制在0.2~0.7读数范围内时,测量的准确度较高.
(3)选择参比溶液:参比溶液是用来调节仪器工作零点的.若样品溶液,试剂,显色剂无无色可用蒸馏水作参比溶液;反之应采用不加显色剂的样品液作参比溶液.
2.5显色反应及其影响因素
显色反应及其影响因素
显色反应
一般要求
影响显色
反应因素
选择性好
灵敏度高
生成的有色化合物性质稳定
显色剂与有色物颜色反差大
显色反应要易于控制
显色剂用量
反应液的酸碱度(pH)
反应温度
显色反应时间
干扰离子的影响
2.5.1显色反应一般要求
(1)选择性好:显色剂最好只与一种被测组分起显色反应;
(2)灵敏度高:灵敏度高有笪微量组分的测定;
(3)有色化合物性质稳定:确保前后测定准确.
(4)显色剂与有色物颜色反差大:两者最大吸收波长之差应大于60nm;
(5)显色反应要易于控制:结果的确保实验再现性.
2.5.2影响显色反应的主要因素
(1)显色剂用量:通过实验来确定最适用量;
(2)反应液的酸碱度(pH)溶液酸碱度直接影响金属离子与显色剂存在形式以及有色化合物组成的稳定性.
(3)反应温度:不同的显色反应需要不同的反应温度,一般显色反应可在室温下完成.
(4)显色反应时间:显色反应的速度有快有慢.
(5)干扰离子的影响:应采用适当方法消除其影响.
3.7200型分光光度计的正确使用方法
3.1结构和工作原理
3.1.1仪器结构
3.1.2工作原理
3.1.3特点
3.2使用方法
3.3注意事项
3.1.17200型分光光度计仪器结构
7200型光栅分光光度计由光源,单色器,试样室,光电管,线性运算放大器,对数运算放大器及数字显示器等部件组成,基本结构如下图所示.
1.光源;2.单色器;3.试样室;4.光电管;5.线性运算放大器;6.对数运算放大器;7.数字显示器
3.1.27200型分光光度计工作原理(图)
7200型光栅分光光度计光学系统示意图
1.光源灯;2.滤光片;3.球面反射镜;4.入射狭缝;5.保护玻璃;6.平面反射镜;7.准直镜;8.光栅;9.保护玻璃;10.出射狭缝;11.聚光镜;12.试样室;13.光门;14.光电管;
3.1.27200型分光光度计工作原理(文)
由光源灯(1)发出连续辐射光线,经滤光片(2)和球面反射镜(3)至单色器的入射狭缝(4)聚焦成像,光束通过入射狭缝(4)经平面反射镜(6)到准直镜(7)产生平行光,射至光栅(8)上色散后又以准直镜(7)聚焦在出射狭缝(10)上形成一连续光谱,由出射狭缝选择射出一定波长的单色光,经聚光镜(11)聚光后,通过试样室(12)中的测试溶液部分吸收后,光经光门(13)再照射到光电管(14)上.调整仪器,使透光度为100%,再移动试样架拉手,使同一单色光通过测试溶液后照射到光电管上.如果被测样品有光吸收现象,光量减弱,由光电转换元件将变化的光信号转变为电信号,经线性运算放大器和对数运算放大器处理,将光能的变化程度通过数字显示器显示出来.可根据需要直接在数字显示器上读取透光度(T),吸光度(A)或浓度(C).
3.1.3特点
(1)具有低杂色光,高分辩率的单光束光路结构的单色器;
(2)具有良好的稳定性,重现性和精确的测量读数;
(3)明亮清晰的数字显示器可显示透射比,吸光度,浓度和所设置的波长,提高了仪器的读数准确性;
(4)采用最新微机处理技术,仪器具有自动设置0%T和100%等控制功能;
(5)仪器配有标准的RS-232双向通讯接口,不仅可向计算机发送测试参数,还可接收计算机发出的指令.
(6)在已知标准溶液浓度前提下,测定未知样品浓度;
(7)在已知标准溶液浓度斜率前提下,测定未知样品浓度.
3.27200型分光光度计使用方法(基本操作1)
3.2.1基本操作
(1)通电---仪器自检----预热20min;
(2)用键设置测试方式:透射比(T),吸光度(A),已知标样浓度方式(C)和已知标样浓度斜率(K)方式;
(3)波长选择:用波长调节旋钮设置所需的单色光波长;
(4)放样顺序:打开样品室盖,在1~4号放置比色皿槽中,依次放入%T校具(黑体),参比液,样品液1和样品液2.
(5)校具(黑体)校"0.000":将%T校具(黑体)置入光路,在T方式下按"%T"键,此时仪器自动校正后显示"0.000"
(6)参比液校"100"%T或"0.000"A:将参比液拉入光路中,按"0A/100%T"键调0A/100%T,此时仪器显示"BLA",表示仪器正在自动校正,校正完毕后显示"100"%T或"0.000"A后,表示校正完毕,可以进行样品测定.
(7)样品测定:将两样品液分别拉入光路中,此时若在"T"方式下则可依次显示样品的透射比(透光度)若在"A"方式下,则显示测得的样品吸光度.
3.27200型分光光度计使用方法(浓度测定)
7200型分光光度仪不仅可以测定未知样品的透射比(T)和吸光度(A)这两项基本操作,还可进行未知样品浓度测定.
(1)在已知标准溶液浓度前提下,测定未知样品浓度.
(2)在已知标准溶液浓度斜率前提下,测定未知样品浓度.
备注:以上两种浓度测定的方法请大家参照实验教学教材课后自学.
3.37200型光栅分光光度计的使用注意事项(1)
(1)预热是保证仪器准确稳定的重要步骤.
(2)比色皿的清洁程度,直接影响实验结果.因此,特别要将比色皿清洗干净.先用自来水将用过的比色皿反复冲洗,然后用蒸馏水淋洗,倒立于滤纸片上,待干后再收回比色皿盒中.必要时,还要对比色皿进行更精细的处理,如用浓硝酸或铬酸洗液浸泡,冲洗.
(3)比色皿与分光光度计应配套使用,否则会引起较大的实验误差.比色皿不能单个调换
3.37200型光栅分光光度计的使用注意事项(2)
(4)比色皿内盛液应为其容量的2/3,过少会影响实验结果,过多易在测量过程中外溢,污染仪器.比色皿中试样装入量应为2/3～3/4之间
(5)拿放比色皿时,应持其"毛面",杜绝接触光路通过的"光面".如比色皿外表面有液体,应用绸布拭干,以保证光路通过时不受影响.
(6)若待测液浓度过大,应选用短光径的比色皿,一般应使吸光度读数处于0.1～0.8范围内为宜.由于测定空白,标准和待测溶液时使用同样光径的比色皿,故不必考虑因光径变化而引起的影响.
4.UV-754型紫外-可见分光光度计正确使用方法
4.1紫外分光光度法概述
4.2UV-754型紫外-可见分光光度计结构和工作原理
4.1.1仪器结构
4.1.2工作原理
4.3UV-754型紫外-可见分光光度计使用方法
4.4UV-754型紫外-可见分光光度计使用注意事项
4.1紫外分光光度计法概述(1)
4.1.1定义用紫外光源通过分光光度技术对物质进行测定的方法叫作紫外分光光度法.所使用的仪器叫作紫外分光光度计.
4.1.2原理因为许多化合物的分子结构中存在共轭双键,在200～400nm的紫外光区具有吸收光的特性,所以无需进行显色反应便能直接测定.
4.1.3应用常用于对蛋白质和核酸进行定性,定量测定.蛋白质分子中所含酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸残基在波长280nm处具有最大吸收峰.故常用波长280nm处的吸光度测定蛋白质的浓度.
4.1.4特点
(1)组成核酸的碱基也含有共轭双键,其最大吸收峰的波长在260nm处.但在280nm处也有一定的光吸收,对蛋白质的测定有一定的干扰作用.若分别测定280nm和260nm处的吸光度,可通过经验公式消除核酸对蛋白质测定的影响.
(2)可对微量蛋白质(1～10g/L)不需显色,进行直接定量测定.因此操作简便,而且可回收样品.此外,盐类在280nm处无光吸收,少量盐类也不会影响测定结果.
(3)紫外分光光度法完全符合Lambert-Beer定律的基本原理.在其它条件保持一致的情况下,被测溶液的吸光度与被测溶液的浓度成正比.
4.2UV-754型分光光度计的结构和工作原理
4.2.1仪器结构由光源(钨灯或氚灯),单色器,试样室,接受器(光电管),微电流放大器,A/C转换器,打印机,键盘和显示器等部件组成.微处理机(CPU)通过输入,输出口(I/O)对微电流放大器,显示器和打印机等部件进行控制,实现仪器的整体功能.
4.2.2工作原理(图)
UV-754型紫外-可见分光光度计光学系统示意图
1.氚灯;2.钨灯;3.滤光镜;4.聚光镜;5.入射狭缝;6.平面;7.准直镜;8.光栅;9.出射狭缝;10.聚光镜;11.试样室;12.光门;13.光电管
4.2.2工作原理(文)
由光源氚灯或钨灯(1或2)发出连续辐射光线经滤光镜(3)和聚光镜(4)至单色器入射狭缝(5)处聚焦成像,再经平面反射镜(6)反射至准直镜(7)产生平行光射至光栅(8)在光栅上色散后又经准直镜(7)聚焦在出射狭缝(9)上成一连续光谱,经出射狭缝射出的光在聚光镜(10)聚光后分别通过试样室(11)中的空白溶液(或对照溶液),标准溶液或样品溶液,被部分吸收后光经光门(12)再照射到光电管(13)上.被光电管接收的光信号再被转换成电信号,后者通过输入,输出口(I/O),见上图.进入微处理机进行调零,变换对数,浓度计算以及打印数据等处理,将检测结果通过显示器和打印系统显示出来.
4.3UV-754型分光光度计使用方法(外型)
4.3.1UV-754型紫外可见分光光度计的外观图
1.试样架拉手;2.键盘部分;3.数据打印;4.波长刻度盘;5.波长手轮;6.电源汗关;7.氚灯触发按钮;8.光源室.
4.3UV-754型分光光度计使用方法(键盘)
UV-754型紫外-可见分光光度计的键盘示意图
键盘详细内容说明如下:
4.3UV-754型分光光度计使用方法(键盘内容1)
①功能键:F1～F8,暂无功能,备扩展使用.
②T键:具有三种透光度状态调节功能.
③A/C键:吸光度/浓度转换键,按此键可分别表示"吸光度0～3A","吸光度0～0.lA","吸光度0～0.1A"和"浓度"四种状态.
④送入键:只在"A/C键"处于"浓度"状态时才起作用.
⑤打印键:手动方式时有效,每按一次,便打印一次数据.
⑥控制键:在分别使用"设定+","设定一","倍率","显示方式"和"打印方式"各键时,需与控制键分别联合使用才起作用.
⑦设定+键:在"A/C键"处于"浓度"状态时才能设定"标准浓度值","斜率K值"或"斜率B值"等数据.其功能是将设定数值增加.
4.3UV-754型分光光度计使用方法(键盘内容2)
⑧设定-键:是使设定数值减小,操作与"设定+键"类同.
⑨倍率键:用来设定标准溶液浓度的放大倍数.有"1","0.1"和"0.01"三档,与"控制键"同时按下,倍率便发生相应的变化.
⑩显示方式键:可表示"积分","浓度"和"样品号"三种状态.
(11)打印方式键:存在"自动"(每移动一次试样架,仪器自动打印一次数据),"方式1"(手动方式,每按一次此键,仪器打印一次数据)和"方式2"(每分钟定时打印一次数据)三种状态.每与"控制键"同时按一次此键便改变一个状态.
(12)送纸键:每按一次此键,仪器移动一次打印纸.
(13)TAC:数字显示器显示测定结果或输入的数据.
4.3.2UV-754型紫外可见分光光度计使用方法(1)
(1)测试准备
①将盛有"空白"或"对照"溶液的比色皿处于试样室光路位置;
②选择波长旋动波长手轮选定所需波长;
③确定光源波长在200～290nm时,选择氚灯为光源;波长在290～360nm时,同时以氚灯和钨灯为光源;波长在360～850nm时,选择钨灯为光源;若使用氚灯,需按氚灯触发按钮启动;
④仪器自检显示器显示"754"后,数字显示出现"100.0",表明仪器通过自检程序,此时仪器进入"0～100%","连续"和"自动"状态(打印系统处于自动打印状态)
⑤仪器预热30min后方可进行测试.
4.3.2UV-754型紫外可见分光光度计使用方法(2)
(2)测试过程
①数字显示透光度"100.0"(或吸光度"0.00")2～3s后,将盛有标准溶液的比色皿移至光路,打印系统便自动打印出所得数据;
②将盛有样品溶液的比色皿移至光路,打印系统即自动打印出该样品的数据.待第一个样品数据打印完毕后,将第二个样品置于试样室光路………,若有多个样品,操作以此类推.
(3)打印方式
采用"自动"方式打印,依所选定表达方式可打印出以下数据:No(编号)%T(透光度)或ABS(吸光度)或CONC(浓度)
4.4UV—754型紫外—可见分光光度计注意事项
(1)预热是保证实验结果准确可靠的必要步骤,不可忽略.
(2)在波长320nm以下的实验范围一定要选用石英比色皿,绝不可以玻璃比色皿替代.
(3)比色皿需保持清洁,拿放时要符合要求.
(4)对不同型号和类型的仪器要严格按照使用说明操作.
(5)UV-754型紫外-可见分光光度计还可开展"以校正线进行浓度演算"和"用已知斜率K值与B值进行浓度测定"等多种测试方法.
(6)不同蛋白质所含酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸的数量有所差异,此法对不同蛋白质洋品的测定结果有所影响