葡萄糖氧化酶法
1.原理
葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下使邻联甲苯胺生成蓝色物质，此有色物质在625nm波长下与葡萄糖浓度成正比。通过测定蓝色物质的吸光度可计算样品中葡萄糖的含量。
2.适用范围
适用于谷类、乳类、饮料、酒类等食物样品和血液样品。检出量为0.02mg。
3.仪器
722分光光度计。
4.试剂：
除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。
(1)乙醇。
(2)40%三氯乙酸：称取40g三氯乙酸，用水溶解并稀释至100ml。
(3)2mol/LNaOH溶液：称取8gNaOH，用水溶解并稀释至100ml。
(4)1%邻联甲苯胺溶液：称取0.1g邻联甲苯胺溶解于10ml无水乙醇中，倒入棕色瓶中，4℃冰箱保存。
(5)乙酸缓冲液(pH5.0)：称取14.28g乙酸钠(CH3COONa•3H2O)溶于水中，加入2.7ml冰乙酸，并调节pH5.0，用水定容至1L。
(6)葡萄糖氧化酶溶液：称取一定量的葡萄糖氧化酶(Sigma公司)用水溶解，使酶含量为100U/ml。4℃冰箱保存一周。
(7)过氧化物酶溶液：0.010g辣根过氧化物酶溶于10ml水中，4℃冰箱保存一周。
(8)酶溶液：取100ml乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、过氧化物酶溶液各1ml，混匀。4℃冰箱可保存七周。
(9)酶空白液：取100ml乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、过氧化物酶溶液各1ml，混匀。4℃冰箱保存一周。(注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶)
(10)葡萄糖标准液：将葡萄糖标准品(纯度大于99%)于80℃干燥至恒量。精确称取0.050g，用水移入100ml容量瓶中，定容至刻度线。相当于浓度为0.5mg/ml。
5.操作步骤：
5.1样品处理：
(1)固体样品：称取0.5～5g已粉碎的样品于锥形瓶中，加入50ml水后沸水浴15min。冷却后，转移至100ml容量瓶中并用水定容至刻度。反复摇动混匀样品，过滤，弃初始几滴滤液。收集滤液。如果滤液澄清，可直接或经进一步稀释后用于测定。如果滤液浑浊，吸取20ml滤液转移至另一容量瓶中，加入无水乙醇至刻度。混合后静置至少30min。过滤，滤液用于测定。
(2)液体样品，寡糖、淀粉等碳水化物水解液：吸取2～10ml样品或水解液，加入4倍量乙醇，混和。静置至少30min，过滤后滤液备用。(如果过滤后滤液仍浑浊，或样液体积过少，可3000rpm离心15min，上清液备用。)
(3)新鲜牛乳等样品：吸取0.5～2ml样品，用水稀释，加入3ml40%三氯乙酸溶液。用水定容至100ml，过滤。吸取5ml滤液，用2mol/LNaOH调节pH至中性，用水定容至10ml，备用。
(注：样品处理中80%乙醇的用途是沉淀不溶性多糖和部分蛋白质，40%三氯乙酸用于沉淀蛋白。)
5.2测定：标准管和样品测定管，按下表所列操作(单位：ml)
试剂标准空白管葡萄糖标准管样品空白管样品测定管
葡萄糖标准液——0.1～0.5————
样品提取液————0.50.5
水0.5补至0.5————
酶溶液55——5
酶空白液————5——
上述试剂混合后37℃水浴反应15min，625nm测定吸光度值。
(注意：葡萄糖与酶溶液的成色反应与反应时间密切相关，如反应时间过长，溶液颜色会由蓝转变成灰色，并慢慢产生沉淀，所以反应时间应严格控制好。)
6.计算
根据吸光度值求出葡萄糖标准曲线的回归方程，采用插入法求出样品测定管中葡萄糖含量，再根据稀释定容体积和称样量，计算出样品中葡萄糖含量。
计算公式：
X=(As-Ab)×V×F×0.1
0.5×m
式中:
X——样品中葡萄糖含量，g/100g;
As——由标准回归方程求出的样品测定管中葡萄糖含量，mg;
Ab——由标准回归方程求出的样品空白管中葡萄糖含量，mg;
V——样品定容体积，ml;
F——稀释倍数
0.5——测定时吸取样品提取液的体积，ml;
m——样品质量，g;
0.1——将mg/g转换成g/100g的系数。
7.注意事项
(1)此方法中的酶溶液只能和葡萄糖反应，特异性强，灵敏度高。
(2)如果样品提取液为无色，无需做样品空白。但是有些样品颜色很深，如饮料、菌藻类食物，或样品提取液浑浊，往往干扰测定结果但又难以去除，所以测定这类样品时需做样品空白管以减少干扰。