1.位置空气通过前面开口进入生物安全柜的速度大约为0.45m/s。这样速度的定向气流是极易受到干扰的，包括人员走近生物安全柜所形成的气流，打开窗户，送风系统调整以及开关门等都可能造成影响。因此，最为理想的是，生物安全柜应位于人员活动，物品流动以及可能会扰乱气流的地方。在安全柜的后方以及每一个侧面要尽可能留有30cm的空间，以利用对安全柜的维护。在安全柜的上面应留有30-35cm的空间，以便准确测量空气通过排风过滤器的速度，并便于排风过滤器的更换。
2.操作人员生物安全柜如果使用不当，其防护作用就可能大大地受到影响。操作人员在移动双臂进出安全柜时，需要小心维持前面开口处气流的完整性，双臂应该垂直地缓慢进出前面的开口。手和双臂伸入到生物安全柜中等待大约一分钟，以便安全柜调整完毕并且让里面的空气“扫过”手和双臂的表面以后，才可以开始对物品进行处理。要在开始实验之前将所有必须的物品置于安全柜内，以尽可能减少双臂进出前面开口的次数。
3.物品放置二级生物安全柜前面的进气格栅不能被纸，仪器设备或其他物品阻挡。放入安全柜内的物品应采用70%酒精来消除表面污染。可以在消毒剂浸湿的毛巾上进行实验，以吸收可能溅出的液滴。所有物品应尽可能地放在工作台后部靠近工作台边缘的位置，并使其在操作中不会阻挡候补格栅。可产生气溶胶的设备(例如混匀器，离心机等)应靠近安全柜的后部放置。像有生物危害性的废弃物袋，盛放废弃吸管的盘子以及吸滤瓶等体积较大的物品，应该放在安全柜内的某一侧。在工作台面上的实验操作应该按照从清洁区到污染区的方向进行。耐高压灭菌的生物危害性废弃物袋以及吸管盛放盘不应放在安全柜的外面，否则在使用这些物品时双臂就必须频繁进出安全柜，这样会干扰安全柜空气屏障的完整性，从而影响对人员和物品的防护。
4.操作和维护大多数生物安全柜的设计允许全天24小时工作。研究人员还发现，连续工作有助于控制实验室中灰尘和颗粒的水平。向房间中排风或通过套管接口与专门的排风管相连接的一级A1和A2型生物安全柜，在不使用时是可以关闭的。其他如二级B1和二级B2型生物安全柜，是通过硬管安装的，就必须始终保持空气流动以维持房间空气的平衡。在开始工作以前以及完成工作以后，应至少让安全柜工作5分钟来完成“净化”的过程，应即应留在将污染的空气派出安全柜的时间。生物安全柜的所有维修工作应该由有资质的专业人员来进行。在生物安全柜操作中出现的任何故障都应该报告，并应在再次使用之前进行维修。
5.紫外灯生物安全柜中不需要紫外灯。如果使用紫外灯的话，应该每周进行清洁，以除去可能影响其杀菌效果的灰尘和污垢。在安全柜重新认证时，要检查紫外线的强度，以确保有适当的光发射量。房间中有人时一定要关闭紫外灯，以保护眼睛和皮肤，避免因不慎暴露而造成伤害。
6.明火在生物安全柜内所形成的几乎没有微生物的环境中，应避免使用明火。使用明火会对气流产生影响，并且在处理挥发性物品和易燃物品时，也易造成危险。在对接种环进行灭菌时，可以使用微型燃烧器或电炉，而不应使用明火。