真空冷冻干燥机工作原理是指通过升华从冻结的生物产品中去除水分或其他溶剂的过程。升华指的是溶剂，比如水，象干冰一样，不经过液态，从固态直接变为气态的过程。冷冻干燥得到的产物称作冻干物(lyophilizer)，该过程称作冻干(lyophilization)。传统的干燥会引起材料皱缩，破坏细胞。在冰冻干燥过程中样品的结构不会被破坏，因为固体成份被在其位置上的坚冰支持着。在冰升华时，它会留下孔隙在干燥的剩余物质里。这样就保留了产品的生物和化学结构及其活性的完整性。在实验室中，冻干有很多不同的用途，它在许多生物化学与制药应用中是不可缺少的。它被用来获得可长时期保存的生物材料，例如微生物培养、酶、血液、与药品，除长期保存的稳定性以外，还保留了其固有的生物活性与结构。为此，冻干被用于准备用做结构研究(例如电镜研究)的组织样品。冷冻干燥也应用于化学分析中，它能得到干燥态的样品，或者浓缩样品以增加分析敏感度。冻干使样品成分稳定，也不需改变化学组成，是理想的分析辅助手段。冷冻干燥可以自然发生。在自然情况下，这一过程缓慢而且不可预测。通过冷冻干燥系统，人们改进、细分了很多步骤，加速了这一过程。
一个基本的冷冻干燥系统包括：一个干燥室或者多歧管一个抽真空系统克服阻碍因素和加速气体流动一个热源提供能量一个低温冷凝器，用于使蒸气压差最大化并捕捉蒸气使之冻结，避免水蒸气污染真空泵。
冷冻干燥过程包含三个步骤：
预冻，为接下来的升华过程准备样品。
初级干燥，在此过程中，冰升华而不融化。
次级干燥，在此过程中，键和于固体物质的残留水分被除去，从而留下干燥样品，这一步骤对保存样品的稳定性非常重要。在壳式预冻中，冻干瓶中的样品浸放在低温热传导液体里旋转，液体样品沿冻干瓶圆周内壁结冻，以达到更大的表面积。这层薄的结冻层能让水分子更加容易地穿过。一旦样品结冰，就可以与冷冻干燥系统连接了。初级和次级干燥发生在样品瓶被连接到冻干系统时，样品立刻暴露在一个真空条件下，从而克服气流阻力。同时热量被提供做能量。为接在干燥箱或多歧管的冻干瓶和其它玻璃容器提供热量的热源是室温空气浴。在自动压盖上箱，是加热层供给。真空和热量这些条件可帮助从冰中升华出的水蒸气更容易地流离样品和表层已冻干的物质。冰冻样品的升华效率取决于几个因素。其中最重要的冷冻产品与收集器之间的气压差。最有效的冷冻干燥发生在样品在它所能承受的最高温度，同时仍能保持冰冻状态，与此同时收集器温度和系统真空度保持在所能达到的最低值。干燥时间的变化依赖于被冷冻干燥的材料的低共熔温度。对于绝大多数的生物材料，这个温度低于0℃，有的甚至要低至-40℃。高的气压差和温差将产生有效的干燥。在初级冻干完成后，所有的冰即被升华。但是结合水仍旧存在于产品中，在次级干燥时，最后相的干燥，牢固键合于固体样品的水，被称为吸收水转变成蒸气。这一过程被称为解吸作用。解吸是一个缓慢的过程，因为吸收水比液体水在同一温度下气压更低。冷冻干燥在样品和收集器的蒸气压力相等时彻底完成。如果样品在未完全干燥时过早的脱离系统，它也许会很快的降解和失去结构及生物性能。