熟悉紫外可见分光光度计的技术指标,是最重要、最关键的核心问题;不管是紫外可见分光光度计的使用者还是制造者,都必须重视这个问题。对制造者来讲,做出的紫外可见分光光度计仪器应该好用。所谓“好用”,就是紫外可见分光光度计“稳定可靠”。所谓“稳定”,就是漂移小、重复性好。所谓“可靠”,就是紫外可见分光光度计的分析测试结果的准确度高(可靠性的含义将在本书后面详细讨论,此不赘述)。而准确度又与杂散光、光度噪声、基线平直度、光谱带宽等许多技术指标有关。对于使用者来讲,就是要用好紫外可见分光光度计。要用好一台紫外可见分光光度计,首先要认真阅读仪器的使用说明书,要对仪器的结构有初步了解,能正确操作仪器,掌握仪器的基本保养维护知识。特别要认真了解仪器的技术指标及其物理意义与简单的检测方法,以及这些技术指标相互之间的关系与对分析测试结果误差的影响。以便经常检测仪器的技术指标,保证仪器工作在最佳状态。
光度准确度(PhotometricAccuracy)是一个非常重要的技术指标。任何使用者买一台紫外可见分光光度计都是为了分析工作,进行分析工作的目的是出数据,其基本要求是数据要准确可靠,这在很大程度上取决于仪器的光度准确度这个最重要的技术指标及其有关指标。
一、光度准确度的表示方法
目前,国际上对紫外可见分光光度计光度准确度的表示方法主要有两种:一种是吸光度准确度(AbsorbanceAccuracy)或吸光度误差(AbsorbanceError),用AA(或ΔA)表示;另一种是透射比准确度(TransmittanceAccuracy)或透射比误差,用TA(或ΔT)表示。国外的紫外可见分光光度计制造商,绝大多数都给出吸光度准确度或吸光度误差AA(或ΔA),并都指出在什么吸光度情况下测量。如美国Varian公司的Cary500、Lambda900等仪器,都给出在1.0Abs时,吸光度准确度或吸光度误差AA(或ΔA)为±0.003Abs。
但国外有少数仪器制造商在给出吸光度准确度或吸光度误差AA(或ΔA)的同时,还给出透射比准确度或透射比误差TA(或ΔT)。我国生产紫外可见分光光度计的厂商,很多都在给出吸光度准确度或吸光度误差AA(或ΔA)的同时,也给出透射比准确度或透射比误差TA或ΔT)。
一般来说，只给透射比准确度或透射比误差TA(或ΔT),而不给吸光度准确度或吸光度误差AA(或ΔA)是不合适的,原因如下:
第一,若给出TA(或ΔT)=±0.5%T,而不讲明在什么透射比情况下测试,就应理解为在0～100%T范围内的任何地方测试都能达到TA(或ΔT)=±0.5%T。但实际上,若在10%T处测量,TA(或ΔT)=±0.5%T时产生的透射比相对误差为±5%。而在90%T处测量,则TA(或ΔT)=±0.5%T时产生的透射比相对误差为±0.56%,二者相差很大。也就是说,不可能在0～100%T范围内的任何地方测试都能达到TA(或ΔT)=±0.5%T。
第二,用户在使用紫外可见分光光度计时,基本上没有人只用透射比T和透射比误差TA(或ΔT)来表示光度准确度和分析测试误差。相反,大家一般都用吸光度值A和吸光度误差AA(或ΔA)来表示分析测试结果和分析误差。
第三,目前国际上绝大多数使用者,都是采用吸光度值A和吸光度误差AA(或ΔA)来表示紫外可见分光光度计的分析测试结果和分析误差。
第四,吸光度准确度或吸光度误差AA(或ΔA)和透射比准确度或透射比误差TA(或ΔT),在使用时二者在数值上会相差很大。若要把TA(或ΔT)=±0.5%T换算成AA(或ΔA),则在10%T处(相当在1A处),±0.5%T的透射比误差,产生的AA(或ΔA)为±0.022A,而在90%T处(相当在0.0046A处),TA(或ΔT)=±0.5%T时产生的AA(或ΔA)为±0.0024A,这同样是一个惊人的差距。因此,在给出一台紫外可见分光光度计的光度准确度时,不管是用吸光度准确度或吸光度误差AA(或ΔA)表示,还是用透射比准确度或透射比误差TA(或ΔT)表示,都应该指出在多少吸光度或在多少透射比情况下测试。
但是,目前仍有许多厂商在给出透射比准确度或透射比误差TA(或ΔT)时,都一律写成±0.3%T。特别是许多制造厂商对自称是高档紫外可见分光光度计的仪器,基本上都是写成“±0.3%T(0～100%T)”。如日本岛津的UV-2401PC、UV-2450PC、UV-2550PC等紫外可见分光光度计。从理论上讲任何高档紫外可见分光光度计的透射比准确度或透射比误差TA(或ΔT)不可能在0～100%T内都能达到±0.3%T的透射比准确度。
目前，国内外都有一些厂商在说明书或仪器样本中称“光度准确度”为“测光精度”,这种称谓混淆了准确(Accuuracy)和精密度(Precision)的概念。准确度是指的测量值与理论值之差,该偏差越小说明测量的数据越准确可靠,或者说光度准确度越高。而精密度是指的分析测试数据的离散性或重复性,是指同一操作者,在一次开机中连续重复多次测试某一吸收峰的吸光度值中最大与最小值之差。该差值越小,说明该仪器的光度重复性越好。
正确的说法应该是紫外可见分光光度计的“光度准确度”而不能说成“测光精度”。光度精密度或光度重复性是指多次测量中的离散性。如3次或5次测量中吸光度的最大值与最小值之差即为光度精密度或光度重复性。而准确度则是指实际测量的吸光度值与真值或理论值之差。
二、影响光度准确度的主要因素
影响紫外可见分光光度计光度准确度的主要因素有以下几个方面。
①仪器的杂散光大小。
②仪器的光度噪声。
③仪器的基线平直度。
④仪器的光谱带宽。
⑤试样的来源,包括样品的制备,取样的方法。
⑥样品的制备,包括称量、容量、溶剂、试剂、pH值、时间、温度等。
⑦比色皿的性能等。
由此可知,光度准确度或吸光度误差AA(或ΔA)是一个综合性的技术指标。要使用紫外可见分光光度计测得准确可靠的数据,必须注重上述几个方面的影响。否则,不可能得到准确可靠的数据。特别应该指出的是,在给出吸光度误差AA(或ΔA),同时也给出透射比误差TA(或ΔT)时,二者不能相互矛盾。
三、光度准确度的标准测试方法
用于紫外可见分光光度计的光度准确度测试的材料,应该是纯度高、稳定性好的物质。这些物质中最主要的是铬酸钾(K2CrO4,一般在碱性溶液中)、重铬酸钾(K2Cr2O7,一般在酸性溶液中)、硝酸钾、中性滤光片等。在碱性溶液中的铬酸钾是一种好材料,但是因为含有碱性,不能储藏在普通玻璃容器中,而需要储藏在石英器皿中,硝酸钾本身不大稳定。这些都限制了它们的使用。因此,最好选择易于纯化又溶于酸性介质中的物质,并且它们的稀溶液也是很稳定的。因此,重铬酸钾的0.005mol/LH2SO4溶液经常被使用。
紫外可见分光光度计的光度准确度测试方法,目前国内外各生产厂家作法不一,其主要原因是各国的国家标准不同;如美国国家标准规定:“选择合适的标准参比材料,在规定的波长处,连续测10个吸光度或透射比读数,取10个读数的平均值,实际吸光度或透射比与观测值的平均值之差,即为光度准确度”
美国NBS规定,在可见区用930标准片来测定光度准确度,其标准透射比值分别为10%、20%、30%的中性玻璃滤光片。规定还指出也可用NBS的931,它是一种溶液。而在紫外区内,则规定用NBS的203来测定光度准确度;它是一种标准透射比值分别为90%、30%、10%熔融石英滤光片。此外,美国标准还规定在紫外区内,用户还可以自己配置高纯度的化合物溶液来测定光度准确度。为此,美国NBS已发布了铬酸钾(K2CrO4)、重铬酸钾(K2Cr2O7)等标准物质可供选用。
我国在1992年制订的紫外可见分光光度计国家标准中规定,用重铬酸钾溶液来测试紫外区的光度准确度,并明确指出了测试波长。在可见光区规定可用中性滤光片来检测光度准确度,其标准片的透射比值分别为10%、20%、40%左右;同时还规定在紫外可见整个区间,都可用中性滤光片来检测光度准确度,其标准片的透射比值也分别为10%、20%、40%左右。