叶绿素理化性质的测定

  仪器信息网 ·  2011-11-10 08:37  ·  45929 次点击
一、原理
叶绿素是一种二羧酸—叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯,故可与碱起皂化反应而生成醇(甲醇和叶绿醇)和叶绿酸的盐,产生的盐能溶于水中,可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开;叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性,表现出一定的吸收光谱,可用分光镜检查或用分光光度计精确测定;叶绿素吸收光量子而转变成激发态,激发态的叶绿素分子很不稳定,当它变回到基态时可发射出红光量子,因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定,容易受强光的破坏,特别是当叶绿素与蛋白质分离以后,破坏更快,而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素,后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素,铜代叶绿素很稳定,在光下不易破坏,故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
二、仪器与用具
20ml刻度试管;10ml小试管;试管架;分光镜;石棉网;药匙;烧杯(100ml);酒精灯;玻棒;铁三角架;刻度吸量管2ml、5ml各1支;火柴。
三、试剂
1.95%乙醇;苯;醋酸铜粉末;5%的稀盐酸;
2.醋酸-醋酸铜溶液:6g醋酸酮溶于100ml50%的醋酸中,再加蒸馏水4倍稀释而成;
3.KOH-甲醇溶液:20gKOH溶于100ml甲醇中,过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。
四、方法
用叶绿体色素乙醇溶液和水研磨匀浆,进行以下实验。
1.光对叶绿素的破坏作用
(1)取4支小试管,其中两支各加入5ml用水研磨的叶片匀浆,另外两支各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液,并用95%乙醇稀释1倍。
(2)取1支装有叶绿素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片均浆的试管,放在直射光下,另外两支放到暗处,40min后对比观察颜色有何变化,解释其原因。
2.荧光现象的观察
取1支20ml刻度试管加入5ml浓的叶绿体色素乙醇提取液,在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同?解释原因。
3.皂化作用(绿色素与黄色素的分离)
(1)在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml20%KOH-甲醇溶液,充分摇匀。
(2)片刻后,加入5ml苯,摇匀,再沿试管壁慢慢加入1~1.5ml蒸馏水,轻轻混匀(勿激烈摇荡),于试管架上静置分层。若溶液不分层,则用滴管吸取蒸馏水,沿管壁滴加,边滴加边摇动,直到溶液开始分层时,静置。可以看到溶液逐渐分为两层,下层是稀的乙醇溶液,其中溶有皂化的叶绿素a和b(以及少量的叶黄素);上层是苯溶液,其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。
4.吸收光谱的观察
将上述已分层的试管溶液,用分光镜观察两类色素的吸收光谱,首先让下层绿色素部分对准进光孔,看光谱有何变化;然后再将上层黄色素溶液对准进光孔,看光谱又有何变化。把观察的结果用简单的图表示出来。
5.H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用
方法一:
(1)取两支试管,第一支试管加叶绿体色素提取液2ml,作为对照。第二支试管中加叶绿体色素提取液5ml,再加入5%HCl数滴,摇匀,观察溶液颜色变化。
(2)当溶液变褐后,再加入少量醋酸铜粉末,微微加热,观察记载溶液颜色变化情况,并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。
方法二:
另取醋酸-醋酸铜溶液20ml,以烧杯盛之。取新鲜植物叶片两片,放入烧杯中,用酒精灯慢慢加热,随时观察并记录叶片颜色的变化,直至颜色不再变化为止。解释原因。
五、注意事项
1.在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液,易乳化而出现白絮状物,溶液浑浊,且不分层。可激烈摇匀,放在30~40℃的水浴中加热,溶液很快分层,絮状物消失,溶液变得清澈透明。
2.分离色素用的圆形滤纸,在中心打的小圆孔,周围必须整齐,否则分离的色素不是一个同心圆

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