一、原理
叶绿素是一种二羧酸—叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇(甲醇和叶绿醇)和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开;叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定;叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
二、仪器与用具
20ml刻度试管;10ml小试管;试管架;分光镜;石棉网;药匙;烧杯(100ml);酒精灯;玻棒;铁三角架;刻度吸量管2ml、5ml各1支;火柴。
三、试剂
1.95%乙醇;苯;醋酸铜粉末;5%的稀盐酸;
2.醋酸-醋酸铜溶液：6g醋酸酮溶于100ml50%的醋酸中，再加蒸馏水4倍稀释而成;
3.KOH-甲醇溶液：20gKOH溶于100ml甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。
四、方法
用叶绿体色素乙醇溶液和水研磨匀浆，进行以下实验。
1.光对叶绿素的破坏作用
(1)取4支小试管，其中两支各加入5ml用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀释1倍。
(2)取1支装有叶绿素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片均浆的试管，放在直射光下，另外两支放到暗处，40min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。
2.荧光现象的观察
取1支20ml刻度试管加入5ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同?解释原因。
3.皂化作用(绿色素与黄色素的分离)
(1)在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀。
(2)片刻后，加入5ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1~1.5ml蒸馏水，轻轻混匀(勿激烈摇荡)，于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b(以及少量的叶黄素);上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。
4.吸收光谱的观察
将上述已分层的试管溶液，用分光镜观察两类色素的吸收光谱，首先让下层绿色素部分对准进光孔，看光谱有何变化;然后再将上层黄色素溶液对准进光孔，看光谱又有何变化。把观察的结果用简单的图表示出来。
5.H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用
方法一：
(1)取两支试管，第一支试管加叶绿体色素提取液2ml，作为对照。第二支试管中加叶绿体色素提取液5ml，再加入5%HCl数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。
(2)当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察记载溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。
方法二：
另取醋酸-醋酸铜溶液20ml，以烧杯盛之。取新鲜植物叶片两片，放入烧杯中，用酒精灯慢慢加热，随时观察并记录叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。解释原因。
五、注意事项
1.在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白絮状物，溶液浑浊，且不分层。可激烈摇匀，放在30~40℃的水浴中加热，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。
2.分离色素用的圆形滤纸，在中心打的小圆孔，周围必须整齐，否则分离的色素不是一个同心圆