使用氯化钠溶液对样品表面进行处理有助于提高加合离子的得率。在分析过程中加热样品也有助于提高得率。在FAB离子化过程中，可同时生成正负两种离子，这两种离子都可以进行质谱分析。样品分子如带有强电子捕获结构，特别是带有卤素原子，则可以产生大量的负离子。
该技术用酶（最常用的是胰酶）对由2-DE分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂，断裂所产生的蛋白片段的精确分子量通过质谱来测量（MALDI-TOF-MS，或为ESI-MS），采用这一技术所获得的肽段的质量可精确至0.1个分子量单位。所有肽段质量最后与数据库中理论肽段质量相配比（理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白产生的）。配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一个“排行榜”，“冠军”肽片段可能代表一个未知蛋白。若冠亚军之间的肽片段存在较大差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明鉴定正确的可能性较大。
肽质指纹术本身并不能揭示所衍生的肽片段或蛋白质。为进一步鉴定蛋白质，出现了一系列质谱分析方法，可用来描述肽片段。用酶或化学方法从N-或C-末端按顺序除去氨基酸，便形成梯形肽片段。以一种可控制的化学模式从N-末端降解，可产生大小不同的一系列的梯形肽片段，而且所得一定数目的肽质量可由MALDI-TOF-MS测量。另一种方法涉及羧基肽酶的应用，该方法从C-末端除去不同数目的氨基酸后便形成肽片段。化学法和酶法可产生相对较长的序列，其分子量非常精确，以至于连赖氨酸（128.09）和谷氨酰胺（128.06）这两个分子量相差无几的氨基酸都能细致区分。或者，在质谱仪内应用源后衰变（PSD）和碰撞诱导解离（CID）技术，目的是产生包含有仅异于一个氨基酸残基质量的一系列肽峰的质谱。因此，可以基于此来推测肽序列。而且，在MALDI反应器上分析肽片段PSD就能产生部分序列信息。