纸上层析是利用混合物中各组分在固定相和流动相中的溶解度不同而达到分离目的，常用滤纸作载体，滤纸上所吸收的水分作固定相，有机溶剂作流动相，称展开剂。层析法有专用滤纸，也可用质量较好的普通滤纸代替。滤纸要清洁、均匀、平整，剪好的滤纸条没有斜的纸纹，按一定规格剪成纸条备用。所用展开剂应对被分离物质有一定溶解度，通常为含一定比例水的有机溶剂。如分离甲基橙和酚酞可用水-正丁醇溶液作展开剂。
操作时，先要点样。取少量试样，用水或易挥发的有机溶剂（如乙醇、丙酮等）使它完全溶解，配制成浓度约1％的溶液。在滤纸上距一端约2～3厘米处用铅笔画一记号作为原点，用毛细管或微量注射针筒吸取少量试样溶液在原点滴一小滴，每滴试样体积为0.002～0.02毫升，控制点样直径在0.3～0.5厘米左右。晾干后再在原点处重复上述操作1～2次。将已点样并晾干的滤纸悬挂在层析槽内，并使滤纸下端（有点样一端）边缘浸入展开剂液面下约0.5～1厘米，但点样的位置必须在展开剂液面之上，将层析槽盖上。借助于毛细现象，展开剂带动试样中各组分以不同速度沿滤纸逐渐向上移动，因各组分在固定相和流动相中溶解度不同，从而使混合物中各组分在流动相中移动距离不同而得到展开。有的组分展开后就可显示出不同颜色，但有的组分展开后不显色，还要进行显色反应。一般可用显色剂喷雾法使各组分显色，如分离甲基橙和酚酞时用氨水作显色剂，酚类可用三氯化铁的乙醇溶液显色，也有用紫外光照射显色的。