所谓时间分辨,是指随着时间的延长,弱的非特异性荧光信号逐渐消散,只留下强的特异性信号,从而使检测特异度大大增强。
一种能观察物理和化学的瞬态过程并能分辨其时间的光谱。在液相中，很多物理和化学过程，如分子的顺-反异构和定向弛豫、电荷和质子的转移、激发态分子碰撞预解离、能量传递和荧光寿命以及电子在水中溶剂化等，仅需10-8秒就能完成。只有在皮秒激光脉冲实现后才有可能及时地观察这些极快的过程。1966年第一次利用锁模Nd3：YAG激光器获得了皮秒超短脉冲。利用光学延迟（10-9秒／30厘米）或同时泵浦两台染料激光器，可准确地控制泵浦和探测激光脉冲的时间间隔。利用脉宽为4皮秒的297纳米的线偏振激光，可将反式1，2-二苯乙烯泵浦到第一单重激发态的某一特定振转能级。由于偏振光的作用，迫使激发的振转态分子按一定方向排列，因而它的发射和吸收也具有偏振性，当它们还来不及与周围分子发生碰撞时，用第二束594纳米的偏振光脉冲经皮秒光学延迟，进行探测，根据探测光偏振度的变化，便可知道分子内的能量传递过程。实验发现，被激发的振转分子的寿命为24皮秒，如果这种分子被吸附在固体表面上，则激发后寿命仅有3皮秒，将顺式1，2-二苯乙烯溶于正己烷中，用脉宽仅为0.1皮秒的312.5纳米光脉冲泵浦，然后用光学延迟的312.5和625纳米光脉冲分别进行探测，发现顺式体在紫外线作用下首先生成寿命为3皮秒的中间体，然后过渡到寿命为1.35皮秒的电子激发态，最后才转变为反式体，这样便及时地跟踪了分子在光作用下异构化的动态过程。用脉宽为5皮秒的530纳米的光脉冲将溶在四氯化碳中的碘分子离解为原子，然后用同样激光脉冲经衰减和光学延迟后来探测重新生成的碘分子的吸收，这样及时地观察到磺原子逃出液相“笼”进行重合所需的时间为140皮秒。
在气相中，由于分子间作用较弱，小分子之间的传能和反应所需的时间大都在纳秒到毫秒数量级，使用输出脉宽为10纳秒的准分子激光和染料激光来进行泵浦和探测，就能研究分子传能和基元化学反应过程。激光光解可得到反应性很强的自由基碎片，如果在自由基产生后的不同时间内用第二束激光来激励自由基，就能获得它的激光激发谱，这样，就能准确知道在不同时间内自由基的相对粒子数和振动转动布居，从而同时获得自由基的化学反应速率和能量传递速率。对于不发射荧光的分子，可以使用多光子电离、吸收等方法进行测量。