双向电泳（two-dimensionalelectrophoresis）
是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心.双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化.双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离.目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10000个斑点(spot).当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行.
样品制备(sampleprepareation)和溶解同样事关2-DE的成效，目标是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率.用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用.对IEF(isoelectricfocusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质.理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理.而离液剂2mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilizedpHgradients)胶上的转换.三丁基膦(Tributylphosphine，TBP)取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增加］.两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度，作为互补试剂会更有效.在保持样品的完整性的前提下，可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA).除此之外，机械力被用来对蛋白分子解聚，如超声破碎］等.另外，添加PMSF等蛋白酶抑制剂，可保持蛋白完整性.由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的，可在其水化的过程中加样，覆盖整个IPG胶，避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失］.此外，低丰度蛋白(lowabundanceprotein)在细胞内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的“冰山之尖”，故分离低丰度蛋白是一种挑战.亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1～15mg级的标准)、应用敏感性检测，可以提高其敏感性.如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测.提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basicproteins)的分离是另一难点.由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生，对PI(等电点)超过10的碱性蛋白，通过产生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之.亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性.?
2-DE面临的挑战是高分辨率和重复性.高分辨率确保蛋白最大程度的分离，高重复性允许进行凝胶间配比(match).对2-DE而言，有3种方法分离蛋白：1)ISO-DALT(isoelectricfocus)以O’Farrell’s技术为基础.第一向应用载体两性电解质(carrierampholyte,CA)，在管胶内建立pH梯度.随着聚焦时间的延长，pH梯度不稳，易产生阴极漂移.2)NEPHGE(non-equilibriumpHgradientelectrophoresis)用于分离碱性蛋白(pH>7.0).如果聚焦达到平衡状态，碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失.因此，在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成，但很难控制.3)IPG-DALT发展于80年代早期.由于固相pH梯度(ImmobilizedpHgradient,IPG)的出现解决了pH梯度不稳的问题.IPG通过immobiline共价偶联于丙烯酰胺产生固定的pH梯度，克服了IEF的缺点，从而达到高度的重复性.目前可以精确制作线性、渐进性和S型曲线，范围或宽或窄的pH梯度.新的酸性pH3～5或碱性pH6～11的IPG凝胶梯度联合商品化的pH4～7的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群(proteomiccontigs)从而有效分离.
分离后的斑点检测(spotdetection)亦很重要.所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的.此外，还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性.目前，没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术.银染已成为一种检测2-DE的流行方法，可检测少到2～5ng的蛋白，因此较考马斯亮蓝R-250敏感.多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色，一些有机染料不适于PVDF膜.放射性标记不依赖其代谢的活性，并仅适于对合成的蛋白质检测.另有一种改良的2-DE(差异凝胶电泳)，即应用两种不同的染料荧光标记两个样品，使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个，避免了几种2-DE的比较，可在纳克级进行检测.
较早期相比，2-DE有两个主要的进步：首先，极高的重复性使有机体的参考图谱，可通过Internet获得，来比较不同组织类型、不同状态的基因表达；其次，高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术.
常见问题及其解答重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑2D的一向吗？一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完1D和2D胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？这是因为BioRad的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（80％满）的矿物油。跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50μA/胶)？电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过30摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的pH条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的pH区域移动。跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是pH指示剂，当它移动到酸性区时（pH4），颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的pH值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的pI值区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。重泡胀缓冲液(rehydrationbuffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的pH值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。怎样估计2D胶上蛋白质点的分子量和pI值？可以用BioRad生产的2D胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。为什么2D胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？横的脱尾可能是：1）一向等电聚焦不完全；2）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）；3）蛋白的丰度太高。竖的脱尾是因为跑二向时，蛋白的溶解度不好。什么成分会影响2D胶的效果？核酸，盐，去垢剂等等。2D胶的上样量应该在什么范围？上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系，上样量大概在100微克（银染）到500微克（考染）之间。我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩？蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法，沉淀法和透析法。超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少（被膜所吸附）。另外超滤对样品的要求比较高。甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来（丢失）。沉淀法中，又以TCA法最为普遍使用。使用TCA法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的TCA和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境（不含盐，甘油，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液），然后再进行超滤。