1.要根据国家标准和有关的规定，向所有可能使用生物安全柜的用户解释安全柜的使用及限制条件。应发给工作人员书面规定或安全手册或操作手册。特别是必须明确告诉工作人员，在出现溅洒、破碎、方法不当的情况下，安全柜无法保护操作人员。
2.安全柜只有在工作正常时才能使用。
3.安全柜前脸的玻璃观察窗不得在安全柜处使用状态时打开。
4.柜内放置的仪器和材料必须保持在最低数量。静压箱后部的空气循环不得受阻。将材料放入安全柜的工作区之前，应对其表面进行去污处理。
5.柜内不得使用本生灯(一种煤气灯)，因其产生的热会干扰气流并可能损坏过滤器。可以使用微型电焚烧炉，但使用一次性灭菌环则更好。
6.柜内所有的工作要在工作面的中部或后部进行，并能从观察面板中看到。
7.操作手后方的活动要达到最少。
8.操作手不应将手臂来回伸进出柜子，以免干扰气流。
9.前送风格栅不得被便签、滴管、或其他材料堵住，否则会干扰气流从而可能使材料受到污染，使人员处在暴露状态。
10.应在每次工作完成后及一天结束时，使用合适的消毒剂清洁安全柜的表面。
11.柜子的风扇在工作开始前和工作完成后要再各运行5分钟。
生物安全柜安放位置
从生物安全柜前脸的开口流入柜内的气流速度约为0.45米/秒。以这一风速，柜内单向流的一致性易受干扰，很容易被安全柜附近人员的走动、开窗、送风配风器、门的开关所干扰。按理想的布置，应放在远离活动及可能有干扰气流的地方。应尽量在安全柜的后侧及两侧留下30厘米的空间，便于维护作业。柜子上方则留下30~35厘米的高度，以便对排风过滤器的风速进行精确测量，并为排风过滤器的更换留下足够空间。
生物安全柜的清洁与消毒
生物安全柜内的所有物品，包括设备，都应在工作完成之后进行表面去污处理并从柜内取出，因为残留的培养介质可能会提供微生物的生长条件。安全柜的内表面应在每次使用前与使用后进行去污处理。要用消毒剂擦拭工作台表面及内壁面，使用的消毒剂应能杀死柜内可能存在的所有微生物。一天工作结束时，应进行最后表面去污处理，即对工作台、各个侧面、背面及玻璃的里面进行全面擦拭。可以使用漂白粉液或70%酒精，这种对目标生物有效的消毒剂。如使用漂白粉液这种有腐蚀性的消毒剂，则要用灭菌水进行二次擦拭。建议工作柜在清洁、消毒时处在工作状态。如果其未处在工作状态，则应运行5分钟，以便在安全柜关闭前将其中的气体清除掉。
生物安全柜的去污处理
对1级和2级生物安全柜的去污，是将适量的低聚甲醛(使柜内空气中的低聚甲醛的最终浓度为80%)置于电热盘或煎锅上(从柜外控制)。另将一个放有比低聚甲醛多10%的碳酸氢的电热盘或煎锅也放在柜内(在柜外控制)。这第二个容器上应带盖，这个盖子可以从远处取下来(例如系在一根线上，线可以从柜外拉动)。这样可以使提前中和的低聚甲醛达到最小。如果相对温度低于70%，有热水的开口容器。如果没有前隔板，则要用生型塑料挡板，将其用胶带粘在前脸，确保不会有气体漏入房间。当盘内的低聚甲醛已全部挥发或开关已打开1小时后，将开关关闭。将安全柜放置一整晚不得触动。然后将第二个盘子的盖移开并打开其开关，碳酸氢氨开始挥发。这时，关闭盘子的开关，让安全柜开始工作，使碳酸氢氨气循环1小时。然后可以取下前隔板(或塑料挡板)，安全柜即可使用。