液相色谱常见问题及处理方法

  Van ·  2011-02-18 09:27  ·  11859 次点击
HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法
1、样品量不足,解决办法为增加样品量
2、样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
3、样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器
4、检测器衰减太多。调整衰减即可。
5、检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数
6、检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。
7、检测池中有气泡。解决办法为排气。
8、记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。
9、流动相流量不合适。调整流速即可。
10、检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器,重作校正曲线。
为什么HPLC柱柱压过高
柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面,而且常常并不是柱子本身的问题,您可按下面步骤检查问题的起因。
1、拆去保护预柱,看柱压是否还高,否则是保护柱的问题,若柱压仍高,再检查;
2、把色谱柱从仪器上取下,看压力是否下降,否则是管路堵塞,需清洗,若压力下降,再检查;
3、将柱子的进出口反过来接在仪器上,用10倍柱体积的流动相冲洗柱子,(此时不要连接检测器,以防固体颗粒进入流动池)。这时,如果柱压仍不下降,再检查;
4、更换柱子入口筛板,若柱压下降,说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质,正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高,请与厂商联系。一般情况下,在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题,SGE提供的Rheodyne7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?
1、筛板堵塞或柱失效,解决办法是反向冲洗柱子,替换筛板或更换柱子。
2、存在干扰峰,解决办法为使用较长的柱子,改换流动相或更换选择性好的柱子
如何解决HPLC进行分析时保留时间发生漂移或急速变化
漂移现象
1、温度控制不好,解决方法是采用恒温装置,保持柱温恒定
2、流动相发生变化,解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等
3、柱子未平衡好,需对柱子进行更长时间的平衡
快速变化现象
1.流速发生变化,解决办法是重新设定流速,使之保持稳定
2、泵中有气泡,可通过排气等操作将气泡赶出。
3、流动相不合适,解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合
HPLC仪器问题
1、我的HPLC泵压明显的偏高,请问可能的原因?
答:流速设定过高;流动相或进样中有机械杂质,造成保护柱、柱前筛板或在线过滤器阻塞;流动相粘度过大;柱温过低;缓冲盐结晶;压力传感器故障。
2、基线不稳,上下波动或漂移的原因是什么,如何解决?
答:a.流动相有溶解气体;用超声波脱气15-30分钟或用充氦气脱气
b.单向阀堵塞;取下单向阀,用超声波在纯水中超20分钟左右,去处堵塞物
c.泵密封损坏,造成压力波动;更换泵密封
d.系统存在漏液点;确定漏液位置并维修
f.柱后产生气泡;流通池出液口加负压调整器
g.检测器没有设定在最大吸收波长处;将波长调整至最大吸收波长处
h.柱平衡慢,特别是流动相发生变化时;用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
3、接头处为何经常漏液,如何处理?
答:接头没有拧紧;拧松后再紧,手紧接头以手劲为限,不要使用工具,不锈钢接头先用手拧紧,再用专用扳手紧1/4-1/2圈,注意接头中的管路一定要通到底,否则会留下死体积。接头被污染或磨损;建议更换接头。接头不匹配,建议使用同一品牌的配件。
4、进样阀漏液是如何造成的?
答:a.转子密封损坏;更换转子密封
b.定量环阻塞;清洗或更换定量环
c.进样口密封松动;调整松紧度
d.进样针头尺寸不合适,一般是过短;使用恰当的进样针(注意针头形状)
e.废液管中产生虹吸;清空废液管
谱图问题
1、问:造成峰拖尾的原因是什么,如何消除?
答:a.筛板阻塞;反冲色谱柱、更换进口筛板
b.色谱柱塌陷;填充色谱柱
c.有干扰物质的存在;使用更长的色谱柱、改变流动相或更换色谱柱
e.流动相PH值不合适;调整PH值,对于碱性化合物,低PH值更有利于得到对称峰
f.样品与填料表面的溶化点发生反应;加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂或更改色谱柱
2、问:造成峰分叉的原因是什么,如何消除?
答:保护柱或分析柱污染;取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞,拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。样品溶剂不溶于流动相;改变样品溶剂,如果可能采取流动相作为样品溶剂。
3、问:K值增加时,拖尾更严重,这是为什么?
答:反相模式,二级保留效应;
a.加入三乙胺(或碱性样品)
b.加入乙酸(或酸性样品)
c.加入盐或缓冲剂(或离子化样品)
d.更换一支柱子
4、问:保留时间的波动有几种可能的原因?
答:温控不当;调节好柱温。流动相组分变化;防止流动相蒸发、反应等,做梯度时尤其要注意流动相混合的均匀。色谱柱没有平衡;在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。
高效液相色谱仪操作步骤:
1)、过滤流动相,根据需要选择不同的滤膜。
2)、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
3)、打开HPLC工作站(包括计算机软件和色谱仪),连接好流动相管道,连接检测系统。
4)、进入HPLC控制界面主菜单,点击manual,进入手动菜单。
5)、有一段时间没用,或者换了新的流动相,需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵,直接在泵的出水口,用针头抽取。冲洗进样阀,需要在manual菜单下,先点击purge,再点击start,冲洗时速度不要超过10ml/min。
6)、调节流量,初次使用新的流动相,可以先试一下压力,流速越大,压力越大,一般不要超过2000。点击injure,选用合适的流速,点击on,走基线,观察基线的情况。
7)、设计走样方法。点击file,选取selectusersandmethods,可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法,点击newmethod。选取需要的配件,包括进样阀,泵,检测器等,根据需要而不同。选完后,点击protocol。一个完整的走样方法需要包括:a.进样前的稳流,一般2-5分钟;b.基线归零;c.进样阀的loading-inject转换;d.走样时间,随不同的样品而不同。
8)、进样和进样后操作。选定走样方法,点击start。进样,所有的样品均需过滤。方法走完后,点击postrun,可记录数据和做标记等。全部样品走完后,再用上面的方法走一段基线,洗掉剩余物。
9)、关机时,先关计算机,再关液相色谱。
10)、填写登记本,由负责人签字。
注意事项:
1)、流动相均需色谱纯度,水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
2)、柱子是非常脆弱的,第一次做的方法,先不要让液体过柱子。
3)、所有过柱子的液体均需严格的过滤。
4)、压力不能太大,最好不要超过2000psi。

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