摘要：综述了高速逆流色谱在天然产物有效成分分离中的新应用。
关键词：高速逆流色谱；天然产物；分离；综述
中图分类号：R944.9文献标识码：A文章编号：1001-8255(2005)12-0788-04
高速逆流色谱(high-speedcounter-currentchromatography，HSCCC)是利用溶质在两种互不相溶的溶剂系统中分配系数的不同，从而进行分离的色谱法。逆流色谱的发展从逆流分配、液滴逆流色谱到现在的HSCCC历程数十年，技术和设备日臻成熟，广泛应用于中药及天然药物的研发。本文综述了HSCCC在天然产物分离中的新应用。
1HSCCC的原理和特点
HSCCC的流动相、固定相均为液体，且互不相溶。利用螺旋柱运动时产生的离心力，使两相溶剂系统不断混合。固定相保留在聚四氟乙烯管中，利用恒流泵连续输入流动相，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相间持续分配，按分配系数大小被先后洗脱。
HSCCC有几个突出优点：(1)无不可逆吸附。聚四氟乙烯管中的固定相无需载体，为液-液色谱系统，故而消除了气-液和固-液色谱中因使用载体而带来的吸附现象，特别适于分离极性物质和生物活性物质；(2)高回收率。由于流动相和固定相均为液体，样品可全部回收，分离纯化与制备可同
步完成，故特别适于制备性分离；(3)操作简便。
因固定相为液体，体系更换与平衡方便、快捷。与HPLC相比，HSCCC进样量较大，最多可达数克，是HPLC的数百倍；与常压、低压色谱相比，HSCCC的分离能力强，有些样品经一次分离即得到1个甚至多个单体，且分离时间短，数小时即可完成，纯度多在98％以上。分离效果主要与溶剂体系的选择和旋转速度、样品制备、洗脱方法等有关。
2分离植物有效成分
2.1生物碱类
生物碱是重要的天然含氮化合物，对疾病治疗和药物发展等具有重要作用。生物碱在植物中分布非常广泛，至少有50多科120属植物中含有生物碱。近年，用HSCCC已成功分离了多种生物碱。
黄连是重要的中草药，具有抗氧化作用，可治疗头晕、风湿及疲劳等。黄连中主要的生物活性物质包括巴马亭、小檗碱、表小檗碱和黄连碱等。Yang等以氯仿-甲醇-0.2mol/L盐酸(4∶1.5∶20)为两相溶剂，利用HSCCC分离得上述4种生物碱。紫杉醇为抗癌药物，属于二萜类生物碱，碱性极弱，Chiou等采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-乙醇-水(5∶7∶5∶1∶6.5)五元体系分离了紫杉醇和类似物caphalomannine。其它生物碱分离实例见表1。
[attach]46053[/attach]2.2黄酮类
黄酮类化合物多存在于高等植物和羊齿类植物中，常以游离或与糖成苷的形式存在，在花、叶、果实等组织中多为苷类，而在木质部组织中多为游离苷元。主要包括黄酮、异黄酮、二氢黄酮、儿茶精、花色素等及各种衍生物。
黄芪具有抗疲劳、免疫刺激和强心等功效。药理和临床实验表明，黄芪中的异黄酮类具有杀菌和清除超氧化阴离子的活性。Ma等利用HSCCC，以乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水(4∶1∶0.25∶5)为溶剂系统，从黄芪粗提物中出分离出两种异黄酮，纯度均大于95％。Du等利用正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-乙酸-水(1∶2∶1∶1∶5∶1)从大豆中分离出4种异黄酮，纯度均大于90％。其他不同植物中黄酮类成分的分离实例见表2。
[attach]46054[/attach]2.3蒽醌类
蒽醌类化合物是广泛存在的重要天然色素，尤其在高等植物和真菌、地衣等低等植物中更为普遍。袁黎明等利用HSCCC对传统中药大黄中的蒽醌类活性成分进行了制备性分离研究，采用氯仿-甲醇-水(4∶3.8∶2)溶剂系统，分离效果良好。Yang等利用乙醚-水的两相溶剂系统，通过调整流动相pH值，采用梯度洗脱，从大黄中分离了大黄酚、大黄素、大黄素甲醚等羟基蒽醌类化合物，纯度均大于98％。此外，采用氯仿-甲醇-丙酮-水(9∶8∶1∶8)分离芦荟中的蒽醌类物质，得到纯度为95.7％的芦荟大黄素和98.9％的芦荟大黄素甙。
2.4酚类和脂肪酸类
HSCCC对酚类和脂肪酸类物质也有良好的分离效果。丹参的药用有效成分主要为丹参酮类和丹参酚酸，近年的研究多集中于后者。丹参酚酸是水溶性酚类化合物，具有抑制动脉血管内皮舒张、降血压和保护肝脏等活性。Li等采用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(3∶7∶1∶9)为溶剂系统，利用HSCCC从丹参粗提物500mg中得到纯度大于98％的丹参酚酸B342mg。Tian等则从山茱萸的正丁醇提取物中，以乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶1.8∶6)与乙酸乙酯-乙醇-水(5∶0.5∶6)两步分离得到没食子酸，纯度大于97％。
3从微生物和藻类中提取有效成分
类胡萝卜素主要来自高等植物和藻类，具有抗癌、抑制溃疡、防治心脏病等功效，其在藻类中可利用生物反应器大规模连续生产。虾青素是类胡萝卜素中抗氧化活性最强的物质，Li等利用HSCCC，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶6.5∶3)溶剂体系，经一步纯化，从粗品中分离出纯度大于97％的虾青素。此外，用正己烷-乙醇-水(4∶3∶1)可从微藻中分离出纯度为98％的叶黄素。
红曲色素是以微生物法生产的天然食用色素，是红曲菌属真菌发酵粮食所得的代谢产物。目前结构已知的有红色素类、紫红色素类和黄色素类3种。夏明等利用HSCCC，采用石油醚-甲醇-乙酸乙酯-水(3∶6∶5∶4)为两相溶剂，成功分离了上述3种色素。
此外，Lu等用正己烷-甲醇(2∶1)体系从微藻ThraustochytriumATCC26185中分离得到纯度大于95％的鲨烯。
4抗生素的分离纯化
抗生素的分离制备也可采用HSCCC，须注意以下几点：(1)选择极性两相溶剂体系，保证有效组分能够充分溶解；(2)加入适量的疏水性有机溶剂，调整有效组分的分离系数；(3)溶剂体系中加入有机酸，使大部分有效组分进入有机相中；(4)采用低流速进样(0.5ml/min)。
Oka等采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶6∶5∶5)分离得到纯度分别为98.2％、92.3％、97.4％的螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。Harada等采用正丁醇-乙酸乙酯-0.005mol/L三氟乙酸(1.25∶3.75∶5)的溶剂体系，从Lysobacter发酵液分离的WAP-8294A混合物中分离得到了对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有较强抗性的WAP-8294A2。
5总结
HSCCC是一种有独特优势的液相分配色谱技术。其溶剂系统更换灵活，能实现从微克量级的分离分析到克量级的分离制备；可用于天然产物粗提物的去除杂质和单个产物的精制；也可与质谱仪或红外光谱联用进行高纯度分析。HSCCC有望在标准品的制备、天然产物化学成分研究及新药研发等领域得到更广泛的应用。
参考文献（略）