一、分光光度计使用的外部环境要求
分光光度计属于精密仪器，应当妥善保管和精心维护，这样才能保证分光光度计长期使用、长期的稳定可靠、测量精度高。元析公司在多年的生产和应用的过程中，得到了一套在一定环境下维护分光光度计的经验，具体如下：
1、环境温度在条件容许的情况下，尽量保持在15-30摄氏度之间，这样能保持电器件稳定工作，不易老化，使分光光度计不易损坏，灯源的使用寿命得到延长。若条件不容许，在高温的情况下，缩短开机时间，高效使用分光光度计，使电器件不要长期保持在高温下。在低温下，使预热时间比常温下的预热时间要长，这样能保证在仪器稳定的情况下进行测试。
2、环境湿度在条件容许的情况下，尽量保持在60%以下，这样能保证光度计内部的光学件和电器件不易受潮、腐蚀、和上霉。若条件不容许，在高湿度和低湿度的情况尽量保持通风。
3、环境在条件容许的情况下尽量保持洁净，打扫环境时动作不宜太大，不要扬起灰尘，打扫之前用防尘罩盖上分光光度计，不要让灰尘进入分光光度计内部。
二、吸光光度法及722型分光光度计的使用
吸光光度法
基于物质对不同波长的光波具有选择性吸收的能力而建立起来的分析方法。
(一)光线：
光线的波长：200nm-400nm紫外线*
400-750nm可见光*>750nm红外线
光具有波粒二相性，波长不同，其能量不同。
(二)物质的吸收光谱及颜色：
1．物质的原子吸收光谱和原子发射光谱：原子的最外层电子可以选择性吸收特征波长的电磁波成为
激发态而产生的光谱称为原子吸收光谱。激发态原子恢复到基态，则释放出特征波长的光子，形成原子发射光谱。不同的溶液其光谱不同，即不同溶液对不同波长的光其吸收能力不同，对某一特定波长的光存在吸收峰。
2．可见光由赤橙黄绿青兰紫等能量不同的光线组成，当可见光穿过某一溶液时，由于特定波长的
光被吸收而使溶液呈现相应的颜色。(如CuSO4由于吸收了可见光中的黄光(600nm)而成蓝色)不同颜色的溶液对不同波长的光其吸收能力不同。
(三)光吸收的基本定律(Lambert-Beer定律)：
一束平行单色光(Io)通过有色的透明溶液时，一部分的光可以透过溶液(It)，另一部分被溶液吸收(Ia),还有一部分被器皿表面反射(Ir),则：
Io=It+Ia+Ir。那么，该溶液透光率为:T=It/Io。
1．Lambert定律：设有一束平行单色光,通过液层厚度为b的均匀透明溶液,则溶液对光的吸收能力:
A=Ig(Io/It)=Ig(1/T)=k2b
k2为吸光系数，为常数。与入射光波长、溶液性质、浓度和温度有关；A为吸光度(又称光密度
O.D或消光度E)，当入射光波长、吸光溶液的浓度和温度一定时，A与b成正比。
2．Beer定律：设有一束平行单色光,通过浓度为c的均匀透明溶液,则溶液对光的吸收能力:
A=Ig(Io/It)=Ig(1/T)=k4c
k2为常数。由Beer定律可知：当入射光波长、吸光溶液的厚度和温度一定时，A与c成正比。
3．Lambert-Beer定律：综合1.2.得：A=Kbc,
即：当入射光波长、吸光溶液的性质和温度一定时，A与b、c成正比。
(四)吸光光度法的基本原理：
1、不同物质，由于其分子结构和原子组成不同，故对光的吸收光谱不同(如：CuSO4)，在测定不同颜
色的物质浓度时要用最大吸收的波长的入射光，这样测量的灵敏度最高。
2、同一种物质，若浓度不同，则对同一波长的入射光的吸收能力(吸光度)也不同，且成正比关系。
3、
应此，利用特定波长的单色光(通常用最大吸收波长的入射光)照射不同浓度的某一溶液时，所得的吸光度大小应与溶液浓度呈线性关系，故可利用该线性关系通过计算或查标准曲线来求得未知溶液的浓度。
(五)吸光光度法特点：
1．灵敏度高：mg%级、甚至ug%级。
2．准确度高：误差2-5%
3．操作简便、快速，仪器设备不复杂，价格低廉，故应用广泛。
三、分光光度计的使用：
(一)分光光度计的基本原理：利用吸光光度法的原理，采用棱镜或光栅等分光器获得纯度较高的单色光
来测量未知溶液的浓度的方法。
(二)常用分光光度计：可见光、紫外、红外分光光度计，
荧光分光光度计，火焰分光光度计等。
(三)722型分光光度计的结构(略)
(四)分光光度计的操作步骤
1)预热仪器。为使测定稳定，将电源开关打开，使仪器预热20min，为了防止光电管疲劳，不要连续光照。预热仪器时和在不测定时应将比色皿暗箱盖打开，使光路切断。
2)选定波长。根据实验要求，转动波长调节器，使指针指示所需要的单色光波长。
3)固定灵敏度档。根据有色溶液对光的吸收情况，为使吸光度读数为0.2-0.7，选择合适的灵敏度。为此，旋动灵敏度档，使其固定于某一档，在实验过程中不再变动。一般测量固定在“1”档。
4)调节“0”点。轻轻旋动调“0”电位器，使读数表头指针恰好位于透光度为“0”处(此时，比色皿暗箱盖是打开的，光路被切断，光电管不受光照)。
5)调节T=100％。将盛蒸馏水(或空白溶液或纯溶剂)的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，有色溶液放在其它格内，把比色皿暗箱盖子轻轻盖上，转动光量调节器，使透光度T=100％，即表头指针恰好指在T=100％处。
6)测定。轻轻拉动比色皿座架拉杆，使有色溶液进入光路，此时表头指针所示为该有色溶液的吸光度A。读数后，打开比色皿暗箱盖。
7)关机。实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。
四、分光光度计的性能检查(1)波长校正：使用光电比色计或分光光度计，在更换光源灯、重新安装、搬运或检修后，以及仪器工作不正常时，都要进行波长校正。就是正常工作的仪器，每隔一个月也要检查一次波长，必要时进行校正，这样才能保证波长读数与通过样品的波长符合，保证仪器的最大灵敏度。方法常用谱钕滤光片校正法，适用于721型仪可见光区的波长校正，常以585nm或529nm处的吸收峰或T%为标准。鉴于721型仪器的出射光波长较宽，不易将573nm和585nm的两峰或两谷分开，校正时易产生误差，故推荐用529nm处的峰或谷为标准来进行波长校正。校正时，将仪器按要求预热。要求电源电压稳定。波长度盘置580nm处，T%调至最大，在比色杯处放一白纸条，观察是否有光强均匀、边缘无光晕或杂光的光斑，如不符合要求，可调节灯泡位置使其符合要求，是为波长校正的粗调。再把灵敏度扭置于“1”(最低档)，波长度盘对准529nm，电表机械零点为零，在光路空白时调T%为100%T，并反复查零点和100%T稳定情况。将谱钕滤光片插入光路，慢慢旋转波长度盘，找到透光率最低的一点(向左右微旋波长度盘时，该点透光率值均增加)，这一点即为波长529nm。检查波长度盘的指示值是不是529nm，如指示值为534nm，此时波长工误差为5nm，超出规定(±1nm)必须进行调整。
调整方法：将波长度盘对准529nm，从光路取出谱钕滤光片，光路空白时调电表指针到100%T，再将谱钕滤光片插入光路。打开仪器左侧小盖板，找到波长校正螺丝(3个中左侧柄长的一个)；反时针方向微微调节(负误差时顺时针方向)，使电表指针的指示T%为最低。反复检查波长误差情况，直到符合仪器技术指标为止。盖好左侧小盖板，校正结束。
有些高档仪器如岛津UV-260型双光束分光光度计，可使用氢灯或置谱钕滤光片于测定比色槽内，编入滤工扫描程序后，仪器即可自动地在一定波长范围内进行波长校正。高档分光光度仪的光学系统密封在一个单元组件内，若发生故障，波长不准，常须请制造商派专人修理。其它尚有谱线校正法、干涉滤光片校正法和有色溶液校正法等，可参考有关资料。
(2)线性检查：线性检查包括仪器线性及测定方法线性两个方面的检查。线性误差表现为溶液的浓度与吸光度不成线性关系，出现正偏离或负偏离的现象。这种偏离，按比耳定律的现象来自两个方面：一是溶液本身不符合比耳定律，这种现象叫做化学偏离；二是仪器本身各种因素的影响，使吸光度测定值与浓度之间不成线性关系，这种现象叫仪器偏离。此处研究的是后者。仪器偏离的因素很多，如杂光、有限带宽、检测器噪声、环境条件变化、波长的变动、比色杯的误差、辐射光的非平行性、检测器本身的非线性等。
仪器线性检查常用一种在一定波长及一定浓度范围内确知其服从比耳定律的有色物质，配成不同浓度的溶液，来检查仪器本身是否能如实地反映有色物质的浓度变化。这种检查方法与任何被测物质呈色反应等方法学上的问题无关。用测得的吸光度对浓度作图，在理想情况下应是一条直线。常用的方法是用0.8、1.6、2.4、4.0mg/L伊文蓝浓度系列来检查，波长用610nm。
(3)杂光(散光)检查：在吸光度测定中，凡检测器感受到的不需要的辐射都称为杂光。杂光对吸光度测定法的准确性有严重的影响，但却往往被忽视。杂光的来源有：①仪器本身的原因，如单色器的设计、光源的光谱分布、光学原件的老化程度、波带宽度以及仪器内部的反射及散射等；②室内光线过强而漏入仪器，仪器暗室盖不严；③样品本身的原因，如样品有无荧光、样品的散射能力强弱等。
杂光检测方法：①紫外光区的杂光监测可用10±0.1g/L的碘化钠溶液，在240nm处测定的吸光度应大于2.00。此外，也可用12g/L的氯化钾溶液，在220nm处测其透光度，即为杂光量，一般应小于1%T。以上测定均用石英杯，以蒸馏水校零。②在可见光区可使用谱钕滤光片或硫酸镍法检查。先用谱钕滤片校正波长，然后用黑纸片挡住比色杯光路(进口仪器带有比色杯样黑色标柱)之后调整0%T，再用空气做空白调100%T。插入谱钕滤光片，在585nm处测定，其测定值即为杂光水平。
(4)比色杯的质量检查：比色杯一般由玻璃、石英或荧石制成，光径1.0或0.5cm,光线通过时有一部分光为空气与玻璃接触面的反射而损失(4%)，另一部分(很少)为玻璃吸收。比色杯的质量除其原料外，再就是玻璃的厚度均匀，上下一致，各杯彼此相配。厂家多以四个一套供应，且杯口上部外面标有箭头，箭头对光源侧使用。尽管如此，在使用前还是应作质量检查。常用伊文蓝法：将一定量的2.0mg/L的伊文蓝溶液注入比色杯中，比色杯内液面应相等。用一个比色杯作标准，用红色滤光片(波长600～610nm)，用水校零后将此杯的读数准确调至50%T，接着读取其余杯的透光度。透光度相差在±0.5%T范围内者为合格。
(5)稳定性检查：检查方法：将分光光度计及附件接于0.5kVA以上的可调变压器，先调电压为220V，波长固定在650nm，在光路比色杯装以空白液，调读数为90%T处，再将电压升至230V及降至190V，观察透光度的漂移值。若介于88.5%～91.5%T之间为合格。在电源电压不变的条件下，在3分钟内其读数漂移不应超过标尺上限值的±0.5%。
(6)重复性检查：在波长、工作状态、电源电压、比色杯配套等合格的前提下，进行重复检查。在用交流电源供电时，仪器对一种溶液重复测定的读数值差应小于或等于标尺上限值的1%。试验方法：将分析纯重络酸钾于120～150摄氏度烘干2小时，干燥器中冷却。精称509.1mg于1000ml容量瓶中，以蒸馏水溶解并加至刻度，混匀(此液180mg/L铬)。就用液为30、60、180mg铬/L。取波长440nm，将应用液各浓度管连续测3～5次，各浓度管中最大误差小于1%T为合格。
(7)灵敏度检查：将重铬酸钾液配制成30和32.5mg铬/L及120和122.5mg/L铬的4种应用液(浓度差两组各为2.5mg/L铬)。波长440nm，以水校零点，将上述应用液连续测3次吸光度，两组2.5mg/L铬浓度差的吸光度值差都不小于0.01为合格。