一，使用方法概述
1.分光光度法定义与应用
1.1定义:分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术.
1.2特点:灵敏,精确,快速和简便,在复杂组分系统中,不需要分离,即能检测出其中所含的极少量物质.
1.3应用:生物，化学研究中广泛使用的方法之一,广泛用于糖,蛋白质,核酸,酶等的快速定量检测.。
2.分光光度计的基本结构和工作原理
2.1分光光度计的分类
红外分光光度计:测定波长范围为大于760nm的红外光区
可见光分光光度计:测定波长范围为400~760nm的可见光区
紫外分光光度计:测定波长范围为200～400nm的紫外光区
2.2分光光度计工作原理
人眼可见的光只占电磁波谱的很小—部分(400~760nm)
它是一种频率较大的电磁波.电磁波按频率大小,从频率最小的无线电波到频率最大的γ-射线排成一列,即组成电磁波的波谱。2.2.1分光光度计的光谱范围包括波长范围为400~760nm的可见光区和波长范围为200～400nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源.钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400～760nm波长的光谱,光通过三棱镜折射后,可得到由红,橙,黄,绿,蓝,靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源.氘灯的发射光谱:氢灯能发出185～400nm波长的光谱,可作为紫外光光度计的光源.
2.2.2物质的吸收光谱(1)
如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱,它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失,这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱.
不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.
2.2.2物质的吸收光谱(2)
当光线通过某种物质的溶液时,透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收,只有一部分光可透过溶液.入射光=反射光+分散光+吸收光+透过光如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的损失,则:入射光=吸收光十透过光
2.2.3物质吸光度(A)与透射比(T)的关系
物质的吸光度与吸收物质的浓度和液层的厚度成正比,这就是光吸收的基本定律--朗伯-比耳定律.
2.3分光光度计的基本结构
无论哪一类分光光度计都包括:光源,单色器,吸收池,检测器和测量仪表.分光光度计的基本部件
(1):光源:分光光度计上常用的光源有两种:钨丝灯或氢灯,在可见光区,近紫外光区和近红外光区常用钨丝灯作为光源;在紫外光区多使用氢弧灯.
单色器:把混合光波分解为单—波长光的装置.在分光光度计中多用作为色散元件.吸收池比色杯,比色皿,比色池)一般由玻璃,石英或熔凝石英制成,用来盛被测的溶液.在低于350nm的紫外光区工作时,必须采用石英池或熔凝石英池.分光光度计的基本部件:
(2)吸收池(比色皿)必须与光束方向垂直.此外,每套比色皿的质料,厚度应完全相同,以免产生误差.比色皿上的指纹,油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性,因此在使用前务必彻底清洗.
常用光电池,光电管和光电倍增管三种.
测量装置—般常用的紫外光和可见光分光光度计有3种测量装置,即电流表,记录器和数字示值读数单元.现代的仪器常附有自动记录器,可自动描出吸收曲线.
(3)检测器：
棱镜与光栅棱镜:光波通过棱镜时,不同波长的光折射率不同;因而能将不同波长的光分开.玻璃对紫外线的吸收力强,故玻璃棱镜多用于可见光分光光度计.石英棱镜可在整个紫外光区传播光,故在紫外光分光光度计中广为应用.
衍射光栅:在石英或玻璃表面上刻划许多平行线(每英寸约刻15000—30000条).由于刻线处不透光,通过光的干涉和衍射使较长的光波偏折角度大,较短的光波偏折角度小,因而形成光谱.光源照到棱镜(或光栅)以前,先要经过一个入射狭缝,再通过平行光镜使成为平行光束投到棱镜上.透过棱镜的光再经另一聚光镜,在此聚光镜的焦面内可得一清楚的光谱图.如在焦线处放—出射狭缝,转动棱镜使光谱移动,就可以从出射狭缝射出所需要的单色光.整个装置称为"单色器"
光电池
光电池装在一个特制的匣子里面由3层物质组成的圆形或长方形薄片.第一层是一种导电性良好的金属,这是光电池的负极.中间极薄的一层是半导体硒,第3层是铁,这是光电池的正极.当光电池受光照射以后,半导体硒的表面逸出电子,这些电子只向负极方向移动,而不向正极移动,因此在上下两金属片间产生一个电位差,线路连通时即产生电流
光电管
光电管是由封装在真空透明封套里的一个半圆柱型阴极和一个丝阳极组成.阴极的凹画上有一层光电发射材料,此种物质经光照射可发射电子.当在两极间加有电位时,发射出来的电子就流向丝阳极而产生光电流.对于相同的辐射强度,它所产生的电流约为光电池所产生电流的1/4.由于光电管具有很高的电阻,所以产生的电流容易放大.
光电倍增管
它比普通的光电管优越,它可将第一次发射出的电子数目放大到数百万倍.当电子打在兼性阳极上时,能引起更多的电子自表面射出.这些射出的电子又被第二个兼性阳极所吸引,同样再产生更多的电子.
此过程重复9次后,每个光子可形成106~107个电子.这些电子最后被收集在阳极上.所得到的倍增电流可进一步加以放大和测量.
二，分光光度计的使用及维护
在日常使用及维护当中应注意以下几点：
第一，在使用仪器前，必须仔细阅读其使用说明书。
第二，若大幅度改变测试波长，需稍等片刻，等灯热平衡后，重新调零及满度后，再测量。
第三，指针式仪器在未接通电源时，电表的指针必须位于零刻度上。若不是这种情况，需进行机械调零。
第四，操作人员不应轻易触动灯泡及反光镜灯，以免影响光效率。
第五，放大器灵敏度换挡后，必须重新调零。
第六，比色皿使用时要注意其方向性，并应配套使用，以延长其使用寿命。新的比色皿使用前必须进行配对选择，测定其相对厚度，互相偏差不得超过2%透光度，否则影响测定结果。使用完毕后，请立即用蒸馏水冲洗干净(测定有色溶液后，应先用相应的溶剂或(1+3)的硝酸进行浸泡，浸泡时间不宜过长，再用蒸馏水冲洗干净)，并用干净柔软的纱布将水迹擦去，以防止表面光洁度被破坏，影响比色皿的透光率。
第七，比色皿架及比色皿在使用中的正确到位问题。首先，应保证比色皿不倾斜。因为稍许倾斜，就会使参比样品与待测样品的吸收光径长度不一致，还有可能使入射光不能全部通过样品池，导致测试准确度不符合要求。其次，应保证每次测试时，比色皿架推拉到位。若不到位，将影响到测试值的重复性或准确度。
第八，干燥剂的使用问题。干燥剂失效将会导致以下问题：①数显不稳，无法调零或满度。②反射镜发霉或沾污，影响光效率，杂散光增加。因此分光光度计应放置在远离水池等湿度大的地方，并且干燥剂应定期更换或烘烤。
第九，分光光度计的放置位置应符合以下条件：避免阳光直射;避免强电场;避免与较大功率的电器设备共电;避开腐蚀性气体等。
三，常见故障排除
在分光光度计的实际操作过程中，最容易出现的几个典型故障是：①仪器不能调零;②仪器不能调“100%”;③测量过程中，“100%”点经常变动;④数显不稳。
故障类型：仪器不能调零
原因：仪器严重受潮电路故障光门不能完全关闭
排除方法：可打开光电管暗盒，用电吹风吹上一会儿使其干燥，并更换干燥剂;修复光门部件，使其完全关闭;送修理部门，检修电路
故障类型：仪器不能调“100%”光能量不够
原因：比色皿架未落位;光电转换部分老化;电路故障
排除方法：增加灵敏度倍率档位，或调整光源灯的位置。若光源灯变黑，说明光源灯已老化，更换光源灯;调整比色皿架使其落位，更换部件;送修理部门，检修电路
故障类型：测量过程中,“100%”点经常变动
原因：比色皿在比色皿架中放置的位置不一致，或其表面有液滴;电路故障
排除方法：用擦镜纸擦干净比色皿表面，然后将其安放在比色槽的左边，上面用定位夹定位;送修理部门，检修电路
故障类型：数显不稳
原因：预热时间不够;光电管内的干燥剂失效，使微电流放大器受潮;光电管老化、电路等其它原因;光源灯问题;操作不当;环境振动过大、光源附近空气流速大、外界强光照射等;
排除方法：延长预热时间至30分钟左右(部分仪器由于老化等原因，长时间处于工作状态时，也会工作不稳);烘烤电路，并更换或烘烤干燥剂;改善工作环境;更换相同的光电管或送修;光源灯不稳定，更换光源灯，更换时注意防止灯泡污染;注意操作规范，按照使用说明书要求进行操作。
总之，分光光度计是一种精密的分析仪器，在其使用过程中应严格遵守其操作规范，按照使用说明书正确进行操作，并做好日常维护工作，以保证分析结果的准确性。