天然化合物是天然产物化学、药物化学、生物学等许多学科研究的重点对象，生物多样性带来的化合物结构的新颖性以及潜在的可利用价值已经受到人们的广泛关注。然而，由于生态环境复杂、采样条件艰苦，特别是近年来人们环保意识增强等原因，获得的样品量往往很少，有些样品重复获取率几乎为零。样品量少而珍贵不仅是上述学科研究工作的特点，也向分析工作提出挑战;核磁共振作为化合物结构解析的重要手段当然也面临同样的问题。在核磁共振实验中，样品量少使得“分辨率与灵敏度”的问题愈发突出。多样性的实验方法是核磁共振技术的特点和优势，这为用于天然化合物核磁实验方案的制定提供多种选择的可能性。
二维核磁共振实验是化合物结构解析的重要手段，也是核磁共振工作者施展才华的一个重要舞台。打开任何一家谱仪的脉冲序列库，都会发现大量的2D脉冲序列。其中不少脉冲是针对特定问题专门设计，以异核相关实验为例，HXCO、HSQC、HMQC等都可以提供化合物质子与碳的直接相连信息，但谱图效果存在着差异，并可能在一定程度上影响结构解析过程。本工作深入分析以上几种同类功用的二维异核相关方法，通过实验原理和实验结果对它们的优势和局限进行讨论。同时开发具有谱编辑功能的ED-HSQC方法，该实验在完成HSQC实验的同时还实现区分碳级数的功能。在实际应用中当遇到化合物谱峰重叠严重的情况(例如三萜类化合物的1H和13C信号在高场区都严重重叠)时，能在很大程度上提高信息的准确性，大大方便结构解析工作。
1实验部分
1.1仪器参数和试剂
德国布鲁克公司AVANCEDRX500型核磁共振波谱仪，配有11.7Telsa超屏蔽超导磁体、三通道检测系统、5mmZ-梯度反式宽带探头(TBI)以及BVT3000温控单元。实验控制和数据处理由BrukerXWIN-NMR3.5核磁专用转件完成。谱仪的其它常用参数指标见参考文献。实验在恒定室温(295±0.1K)下进行。氘代氯仿(氘代率>99.5%)，北京化工厂产品。
1.2样品
所选用的化合物样品提取自乌头类中药，综合参考文献和多种波谱方法鉴定为粗茎乌碱I(CrassicaulineI)，为双酯二萜类化合物，是乌头中的主要化学成分(见图1)。药理研究证明，这类乌头类生物碱在强心、镇痛、抗肿瘤、调节免疫等方面显示良好的效果。样品溶于氘代氯仿中进行核磁共振实验。
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2结果与讨论
2.1HXCO、HSQC与HMQC实验对比及结果分析图2是相同采样时间内获取的粗茎乌碱I(CrassicaulineI)的三种异核直接相关谱(参数设置见表1))。从图2中可以很明显地看到，三个实验给出的结果虽然一致，但是谱图效果却不尽相同。HSQC的谱图质量要明显更好些。这实际上也是HSQC的优势，但该实验对脉冲的刻度要求比较苛刻，参数设置稍有偏差就可能会造成信号的丢失;就此而言对完全未知的样品进行测试时，HMQC的把握性更大些。HXCO是一种较早的观测异核直接相关的实验方法，从灵敏度的角度看，HXCO(c)谱图的质量显然差些，但比较三张谱图中不难发现该谱中碳维的分辨率有所改善。
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检测直接相连的1H、13C相关关系的2DNMR实验手段有很多，从检测核的角度看可以分为两种，一种是检出13C核的异核位移相关谱如HXCO，另一种就是以HMQC为代表的检出1H的异核位移相关谱，也即逆检测的异核位移相关谱。
HSQC和HMQC等是随着核磁共振谱仪硬件(特别是探头)的发展而出现的一类利用反式检测获取异核相关谱的实验方法。该类方法检测的是与13C直接相连的质子信号;质子弛豫时间短、信号灵敏度高，因此比较容易满足人们希望能在较短的时间内获得高质量谱图的愿望。因此，这类间接采样方法一经出现，对13C直接进行采样检测的异核相关实验便自然而然地被人们忽视。目前，得到广泛应用的异核位移相关实验均是采用这种反转模式的检测方法。在二维谱中，因为F2维的分辨率决定于所用数据点多少而F1维的分辨率决定于t1的递增数，后者远小于前者，因此二维谱F1维的分辨率比F2维要差很多，加之某些HMQC谱的F2方向还可能出现1H-1H之间的耦合裂分，进一步降低F1维的分辨率，因此HMQC与HSQC比较，HMQC谱的F1维(13C维)的分辨率差是其较大的缺点，但该方法对脉冲参数的选择较宽容，所以在未知化合物的结构解析中更实用些。另外，我们的实验结果表明，HMQC谱图能够获得较好的信噪比，而HSQC谱图能获得较好的分辨率。HXCO是一种开发较早的观测异核直接相关的实验方法。由于灵敏度较低而在目前的应用并不普遍，实际上，HXCO在解决一些特殊问题时还是有其特点的。在天然药用化合物的2DNMR测试中，由于样品量少等原因而往往侧重于强调灵敏度或为节省采样时间，分辨率问题有时会被忽略。尽管共振信号在二维上的展开能或多或少弥补2DNMR谱分辨率不高的问题，但反式异核2D测试中13C维(F1维)的分辨率还是明显要比1H维(F2维)差。而HXCO中直接就是针对13C采样维，即13C维是F2维，所以在13C方向上信号的高分辨率是该实验方法的优势所在(见图2-c)，对于某些碳谱线相对比较密集的样品，HXCO谱可能会更利于信号的分辨和观测。但由于13C的天然丰度低、磁旋比小，造成13C的核磁共振信号远弱于1H，因此在遇到低浓度样品时往往不容易得到优质的HXCO图谱，造成它的实际应用受到一些限制。2.2有区分碳级数谱编辑功能的ED-HSQC实验利用谱编辑对碳的类型加以区别是DEPT实验的特色，将这种理念带入异核相关实验中建立的ED-HSQC实验，能够在谱图上将碳与氢不同的结合CH/CH3与CH2直接区分开来，这给谱图的识别带来更大的方便。单从脉冲序列来看，该方法与HSQC基本的脉冲序列很相似，只是中间多加入一段“d21-180º(1H、13C)-d21”序列，这是选择碳极数的关键所在，实验中d21取3/41JCH，此时对于CH、CH3得正信号，而对于CH2则得最大负信号，从而实现对13C核具有选择性的、直接检出1H的异核位移相干方法。
图3是粗茎乌碱I(CrassicaulineI)的EDHSQC谱。图中可以很清楚地把化合物中的甲基、次甲基与亚甲基区分开来，实圈点对应于CH/CH3的信号，而空圈点则对应于CH2的信号，这两大组间的信号处于谱图的正负不同方向，差异非常明显。实际上，通过谱图的处理还可以将两组信号分别呈现在两张独立的谱图上，从而提高谱图的清晰度和解析的把握性。
在实际应用中如遇到化合物谱峰重叠严重的情况，例如三萜类或甾体类化合物均含有不同数量的叔、仲、伯碳所接的CH、CH2和CH3基团，其1H和13C共振谱线多密集在高场区、归属难度大，错判或漏判的可能性是存在的。作为逆检测的异核位移相关实验ED-HSQC，一方面继承常规HSQC实验直接检测质子的灵敏性，另一方面新增加的区分碳级数功能，明显解决HMQC或HSQC实验中碳维分辨率低的问题，相当于同时得到化合物的HSQC谱和DEPT135谱，大大节省实验时间。
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3小结
综合以上讨论可知，在进行天然药用化合物的二维异核相关实验检测时，我们应该充分利用核磁共振实验方法多样化的优势，在工作中根据样品的实际情况加以选择，真正解决好样品量、采样时间和谱图质量（灵敏度和分辨率）三者之间的矛盾。对于常规的检测，我们可以选择对样品浓度和参数选择要求不高，操作也最容易（不需要相位调整）的HMQC实验；对分辨率要求较高时，可以选择HSQC实验；而对于高浓度样品，为得到13C维的高分辨率，也可以选择HXCO实验。另外，如能把ED-HSQC实验作为化合物结构解析的常规NMR实验加以推广的话，无疑将给天然化和物结构解析带来很大的方便。
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