检测技术及其在生命科学中的应用进展

  仪器网 ·  2012-07-14 23:42  ·  43819 次点击
现代检测技术中,检测器(Detector)是分析仪器的重要组成部分。通过吸收光的变化或电的变化等与浓度相关,以检测样品的浓度与含量进行定性和定量分析。要求其灵敏度高、嗓音少,基线稳定,响应值的线性范围宽。近年来各国都在研究开发各种新的检测技术,目前已成功地研究出各种接口(interface),使之将整台仪器做为检测器,开发各种仪器的联用,因而进一步扩大各种仪器的应用范围,现已广泛应用于石油化工、医药卫生、食品环保等各个领域,特别是与高效液相色谱联用,既可很好地分离又可检测,在人体健康的生命科学领域中更具重要意义。
1紫外检测器(UVD)
通常采用固定波长254nm。为获得UV-VU光谱,经各国学者不断研究改进,美国光谱物理(SP)公司推出光栅自动快速扫描UVD。美国Agilent公司推出1100系列HPLC仪,装有高精度二极管阵列检测器(DAD),它由1024个二极管组成,在190~950nm波长范围能自行校正波长,可实时采集全光谱,进行色谱峰的纯度分析、准确定量。操作更加简便快速。Angelika应用HPLC-DAD分离测定土壤、水、泥浆和空气中危害生命的致癌、致突多环芳烃,灵敏度达到ng水平。LIUYuzhen等建立RP-HPLC-DAD法测定防治心血管病药物戊四硝酯粉的含量。实验采用ODS柱,甲醇+水(70+30)为流动相,检测波长206nm,方法简便,重现性好,为控制该药的质量提供可行的方法。FENGYingjie等采用HPLC-DAD法同时测定中药复方丹参制剂中原儿茶酚、丹酚酸B、丹参酮IIA、隐丹参酮、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和Rg1等七种成分,为全面评价其质量标准提供依据。LiuZM等以HPLCUVD法,采用TSKG3000SW分子筛色谱柱(分子量范围1000~300000),流动相为2mol/L尿素,流速1mL/min,检测波长216nm,对男性精液生殖细胞精蛋白进行分离研究,结果首次证实精蛋白(相对分子量4800~25000)异常或含量不足是男性不育的重要原因。王绪明报道Raghuveeran等用RP-HPLC-UVD法测定水中的糜烂性化学毒剂芥子气(HD)。实验采用岛津LC-6AHPLC仪,色谱柱为PolygosilC18不锈钢柱,流动相为甲醇+水(63+37);RCS-C18预柱;流动相为甲醇+水(75+25),二者皆为1.5mL/min,检测波长200nm,结果在10~40μg范围内呈线性关系。本法简便快速准确,为核查化学裁军协定的执行情况提供方法。杨小红等用HPLC-DVD法测定冰毒中毒患者血浆中甲基苯丙胺及其代谢物苯丙胺的含量。为临床快速诊断提供方法,也为打击走私冰毒提供有力的手段。
2荧光检测器(FLD)
FLD的灵敏度比UVD高一个数量级,最适于检测体内微量药物。鲁燕侠等RP-HPLC-FLD,以λex:290nm,λem:330nm同时测定大鼠脑组织中5种神经递质的含量,为临床检测提供参考。温预关等用岛津LC-3AHPLC-FLD法,以λex:345nm和λem:460nm测定抗焦虑、抗惊厥新药扎来普隆(zaleplon)胶囊的含量,研究人体药代动力学。实验选用乙腈+水(50+50)为流动相,分离效果较好,线性范围在1~100ng/mL,方法简便灵敏。经20名志愿者服药,所得之动力学参数为临床用药提供参考。茶叶是一种很好的饮料和保健品,特别是绿茶、铁观音茶具抗癌作用,更是引起人们的重视。为保证茶叶质量,WENYuyun等用HPLC-FLD法测定茶叶中甲氰菊酯等5种菊酯农药残留量,作者以乙腈+水(74+26)为流动相,流速:1.2mL/min,梯度洗脱,柱后衍生化用FLD检测,入ex:221nm,入em:320nm。本法线性范围为0.040~8.0μg/g、RSD为3.4%~6.4%,检出限为0.012~0.048μg/g(干重),结果完全符合欧盟标准的要求。为出口茶叶质量提供保证。
3示差折光检测器(RID)
RID亦为通用检测器,一般用于糖类分析及凝胶渗透色谱。有人曾用HPLC-RID分析麦芽糖等7种糖类及软饮料中果糖、葡萄糖、柠檬酸等成分。RID灵敏度较低,可据情采用。
4电化学检测器(ECD)
ECD为一种灵敏的检测器。根据电化学原理,色谱柱流出物的响应值随电位的变化而不同,在一定电位条件下,可得到不同保留时间的色谱图,灵敏度可达pg水平。杨志凌等应用HPLC-ECD检测法测定猪组织中动物生长促进剂克伦特罗。实验选用1.7mmol/L氯化锂+甲酸+甲醇(65+1+34)为流动相,工作电压1.25V,最低检出限为0.5ng/g,可用于测定猪的肌肉、肺、肝、肾及脂肪组织中的克伦特罗。防止非法使用。李曙光等采用HPLC-ECD法检测鸡肉中10种磺胺药物,结果为20μg/kg。对于控制滥用磺胺类药物,保证食品质量有重要意义。
5红外检测器(IRD)
IRD系从色谱柱分离出的组分,随流动相入红外收池进行测定。近代傅立叶红外分光光度计(FTIR)扫描速度快,计算机数据处理,使之HPLC-IRD得以应用。其中,溶剂的选择尤为重要。20世纪80年代Cheh等人选用氘溶剂如D2O、CD3OD等,用波长5.75μm(羰基)和6.15μm(酰氨基)吸收带测定磷脂类化合物,结果满意。2007年google报道用HPLC-FTIR可测定葡萄酒中的蔗糖、酒精和有机酸。
6核磁共振检测器(NMRD)
Varian公司推出的新NMR检测器,已用于肽的混合物分析。HPLC色谱柱的流出物一方面用UV-VIS控制,同时,由收集器收集样品,最后流入磁场的探头处进行NMR测定。HPLCNMR检测器联用的关键是NMR流动探头。新的HPLC-NMR微量流动探头位于磁场中心处,为体积6μL,ø3mm的外绕NMR线圈流动池,探头的下部为联接HPLC流动相入口和出口的标准探头;另有一个较前大2倍的流动池,用于样品收集器进行停流测量。最近,Varian公司研究开发的低温探头(-250℃),其灵敏度比同类室温探头高4倍以上,对于蛋白质研究和新药开发提供一个全新的视野。而可更换式流动池(FIC)对于天然产品和代谢产物的研究更是简便快速。
7质谱检测器(MSD)
质谱是研究化学结构、鉴别药物毒物的重要工具,特别是与气相色谱联用(GC-MS)更是简便快速。王绪明曾用气相色谱-质谱检测器多次鉴定中毒患者服用的毒物巴比妥药物,为医院抢救提供可靠依据。但对于挥发性低,耐热稳定性差以及高分子、离子型化合物的分析则受到限制。而用HPLC-MS检测器则可和GC-MS相互补充,使分离手段更加完善。HPLC和GC-MS联用的关键是通过接口(interface)相联。由于HPLC流动相的组成比GC载气复杂,因此,对HPLC-MS的接口技术要求更高。目前,较为完善的接口有以下几种。
7.1热喷雾接口(Thermospary.TS)
由HPLC流出的极性溶液,以1~2mL/min流速进入不锈钢毛细管(ID=0.13mm),经加热蒸发呈带正负电荷的雾滴/气溶胶,在一定的能量下,溶剂则被油泵抽走,正离子进入离子源。Ganes等曾用HPLC-TS-MS,同时分离和测定前列腺素D2等药物的分子量。
7.2离子束接口(ParticalBeam,PB)
BP接口为近代发展的HPLC-MS接口新技术。所用的流动相,以0.1~1.0mL/min流入喷雾器,经氦气喷入脱溶剂腔使呈离子束,再在真空条件下,使瞬间分离至二级分液器,经传送杆进入离子源。王绪明曾报道Timonthy采用HPLC-PB-MS,EL/CI离子源,μ-Bondapark色谱柱,流动相为水+乙腈(70+30),流速0.27mL/min,成功地分离鉴定乙烯丙巴比妥等12种巴比妥药物,并给出其色谱图,为巴比妥类药物中毒的鉴定提供参考。
7.3电喷雾接口(Electrospary,ES)
ES是近几年继PB接口之后推出的HPLC-MS新技术。HPLC流出物由电喷雾雾化进入高压筒状电极,使形成一种微滴的细雾,通过热氮气逆流脱溶剂,使离子化进入毛细管,在二级抽真空后出毛细管进入碰撞感应解离区(CID),经分离室聚集成离子束进入离子源。HPLC-ES-MS特别适于蛋白质、多肽和酶的分析,灵敏度可达pmol/μL水平,如测肌红蛋白(MW=16951),灵敏度为20fmol/μL。Oberacher等应用HPLC-ES-MS对人类基因组THO1短串联重复序列系统进行分析,结果与毛细管电泳法完全相符。Sannes等应用HPLC-ES-MS研究人体免疫缺陷病毒(HIV)Tat肽与病毒转移复制RNA应答元件相作用,对艾滋病的机理与防治有意义。郭继芬等应用HPLC-ESMS分析人参皂苷8种成分。对于深入阐明人参功效,开发人参应用价值,寻找新的先导化合物都有重要价值。刘建芳等采用Agilentl100LC/ESI-MSD联用系统,建立测定人血浆中的氟桂利嗪。样品用乙醚+环己烷(2+1)提取,可去除血浆中内源性物质的干扰。方法灵敏专一,最低检测限为0.2ng/mL,适于生物样品分析。经20名健康受试者交叉口服单剂量盐酸氟桂利嗪胶囊20mg,测得血药浓度时间曲线及动力学参数,结果满意。为临床治疗脑血管外周血管疾病患者用药提供检测手段。郭瑞臣等应用HPLC-ESI-MSD测定尼索地平人体中的血浆浓度及药代动力学。由于该药治疗高血压心脏病的作用比硝苯地平强4~10倍。但给药剂量大,遇光不稳定,因此,用常规UV检测达不到要求。而本法灵敏度高,最低检出限为0.15ng/mL,不仅满足低浓度检测,亦可用于生物利用度的研究。杨凤仙等应用HPLC-ESI-MS法,分析水和土壤中有机磷酸化合物异丙磷酸和异丙基磷酸丙酯。采用SIM技术,排除基质干扰,回收率分别为100%和90%,灵敏度1ng/μL。鉴于这些化合物属神经性毒剂如沙林等的水解产物,因此,本法可用于测定化学毒剂。由于灵敏准确故满足禁止化学武器公约组织(OPCW)的第七轮国际联试配样测试工作的需要。LIAifeng等应用HPLCESI-MS法,采用C18反相色谱柱测定河豚毒素(TTX),其线性响应(r=0.9992)良好,检出限为120pg;采用HILIC色谱柱,在SIM模式下定量分析TTX。贝类海鲜,味道鲜美,但有一种神经毒贝,严重危害人的健康甚至生命。FANGXiaoming等应用HPLC-TOF-MS法测定这种毒贝中的短藻毒素PbTx2。定性检出限为0.5ng,定量检测限为0.1μg/g。本法对于监控贝类质量有重要意义。丰英杰等用HPLC-ES-MS法鉴定复方丹参的化学成分及其代谢成分。孙建平等用HPLC-ESI-MS法测定红葡萄酒中芦丁和白藜芦醇糖苷等16种酚类物质,可用于评价葡萄酒产品质量。孙志刚等采用HPLC-ESI-MS测定水产品中的醋酸甲羟孕酮残留量,方法快速、灵敏,可满足我国出口水产品检测的要求。
8蒸发光散射检测器(ELSD)
ELSD对所有不挥发溶质都有响应,是一种较理想的通用检测器。其特点是灵敏度高,检出限为10ng,不受溶剂成分及温度波动的影响,亦可用于梯度洗脱,目前已得到广泛的应用。尹俊发等应用RH-HPLC-ELSD测定安宫牛黄胶囊中的胆酸,为其质量控制提供方法。曾令杰等应用HPLC-ELSD分析新疆伊犁贝母中主要活性生物碱苷以及其苷元的含量。平均回收率为95%~105%。LISonglin等曾用HPLC-ELSD,C18柱,以乙腈+甲醇+水(66.5+3.5+50)内含0.006%的三乙胺为流动相,分析5种贝母中8种生物碱的含量。结果表明,不同产地,不同季节的贝母,生物碱的含量有所不同,为贝母质量的控制提供可行的方法。SHIWei等采用HPLC-ELSD法和微波辅助萃取及梯度洗脱等方法分离和测定人参根中的人参皂苷,其线性关系在0.025~0.5μg/L,回收率在85%~104%,结果发现,随着人参年龄的增长,其人参皂苷的含量也增加,为人参的质量检测提供可靠方法。邬立新等用HPLC-ELSD法测定山茱萸药材中的熊果酸含量。为其质量控质提供方法。
9小角度激光散射检测器(LALISPD)
LALISPD是近代HPLC领域中出现的一种新型检测技术。本法的基本原理是从HPLC流出的高分子溶液如右旋糖酐或胸前肽因子溶液等,在一束光线通过时,除产生透射和反射外,还有因分子的热运动使分子内部形成局部密度变化,而向各个角度发射散射光,称瑞利散射或分子散射。根据光散射公式和样品的测定参数而求蛋白质的相对分子量。目前,该技术在蛋白质药物研究中得到广泛的应用。快速检测多糖、蛋白质类高聚物的分子量及分子量分布参数时,可不需要标准品或外标要求。范慧红等用LALLS法研究海藻多糖绝对分子量及其分布;用MALLS标定不同分子量系列肝素标准品;对大分子蛋白质类药物明胶肽质量进行研究。魏顺安等用激光光散射法同时测定生物材料聚乳酸的分子量及其分布。分别为30000~150000g/mL和1.3~1.8。除上述检测器外,尚有旋光检测器、原子吸收、原子发射、原子荧光检测器等。
综上所述,现代分析技术中,检测器对于药品和食品质量控制、临床医学研究毒物快速分析、环境检测等有关生命科学的发展具有重要意义。
来源:《现代仪器》,转载请注明出处-仪器信息网(www.cncal.com)

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