甲壳素(Chitin，又称为几丁质、甲壳质、甲壳素、壳蛋白和壳多糖等。)是一种天然高分子聚合物，属氨基多糖，结构与纤维素极为相似，是纤维素第二位上的羟基被酰胺基置换的产物,其化学名称是(1，4)-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D葡萄糖，化学结构是由2-乙酰胺基-2-脱氧-D-葡萄糖通过β-1，4糖苷键形式连接而成的多糖，一般统其脱乙酰基产物则为几丁聚糖，其化学名称为聚(1，4苷)-2-胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，一般统称有：甲壳胺，脱乙酰壳多糖和壳聚糖等。壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，也是少数具有荷电性的天然产物之一，因其具有无毒、无二次污染、易被微生物降解等特点同时具有优良的理化性能正被越来越多的科学工作者所研究。因此，对甲壳素与甲壳糖及其衍生物的结构、官能团、组成及其性质的研究尤为重要。本文着重对光谱、核磁共振、质谱、扫描电镜、X射线衍射在甲壳素和壳聚糖及其衍生物中的应用作以介绍。
1光谱
1.1红外光谱(IR)
1.1.1红外光谱在甲壳素和壳聚糖的定性研究Pearson等人较为全面地研究甲壳素的红外光谱。甲壳素的红外吸收谱带在3480cm-1到685cm-1的范围内。壳聚糖的红外光谱与甲壳素的红外光谱差异表现在酰胺谱带、氨基谱带和氢键等方面。α-甲壳素的酰胺Ⅰ谱带是1660cm-1，在近旁还有一个附加谱带1633cm-1，而β-甲壳素就没有这个附加谱带;α-壳聚糖和β-壳聚糖之间没有这种差别。刘海虹等通过红外光谱对壳聚糖缩苯乙醛Schiff碱分析发现，1634.6cm-1处和1663.2cm-1处有C=N对称和不对称伸缩振动峰;1451.3cm-1，l494.2cm-1和l597.2cm-1处有苯环上骨架振动峰;755.4cm-1和698.2cm-1处有单取代苯环的C-C伸缩振动峰,证明壳聚糖与苯乙醛的确发生缩合反应，生成碳氮双键和引入苯环,确认席夫碱的结构。舒红英等合成壳聚糖与马来酸酐的接枝共聚物并对接枝共聚物,采用溴化钾压片法对固体产品及壳聚糖进行红外光谱测试，经谱图比较发现在1710cm-1处吸收峰增强,为C=O伸缩振动，1285cm-1处多一吸收峰,为-COOH伸缩/弯曲振动,表明有-COOH存在,说明壳聚糖与马来酸酐接枝共聚成功。张千弘等对合成的羟丙基壳聚糖进行红外光谱表征，发现在3200~3500cm-1处存在较弱的N-H的伸缩振动吸收带，1600cm-1处的N-H弯曲振动吸收峰,通过壳聚糖和羟丙基壳聚糖红外谱图比较，在3400cm-1左右，为OH的伸缩振动峰，在3200～3500cm-1处存在较弱的N-H的伸缩振动吸收带，还观察到在1600cm-1处的-H弯曲振动吸收峰，由此推断出取代反应在NH2上进行。朱岩等通过对壳聚糖红外光谱测试结果的分析，比较氨基和乙酰基对红外光吸收的强弱，论证红外光谱特征峰的强度可定性地说明壳聚糖脱乙酰化度的大小。张荣等采用二甲基二烯丙基氯化铵(DMDAAC)对壳聚糖进行接枝改性，通过红外光谱对接枝共聚物C-DMDAAC结构进行表征分析，红外光谱图进一步表征C-DMDAAC的生成。另外唐星华等将壳聚糖与甲基丙烯酸(MAA)和醋酸乙烯酯(VAc)两种单体的接技共聚反应后,进行红外光谱表征，经谱图比较,证明MAA与VAc都接枝到壳聚糖的基团上，且打开壳聚糖的六元环。
1.1.2红外光谱在甲壳素中的定量研究用红外光谱法可以测定甲壳素的脱乙酰基程度，还可以对甲壳素或壳聚糖的化学修饰进行定量分析。蒋挺大和卢福道利用红外光谱法测定苄基甲壳素的取代度。甲壳素的每个糖残基上只有C3-OH和C6-OH可被苄基取代。C6-OH是一级羟基，C3-OH是二级羟基，前者反应活性大于后者。当两个羟基全部被苄基取代，则取代度为2。董炎明等以从完全脱乙酰壳聚糖通过均相N-乙酰化法制备的不同脱乙酰度壳聚糖为红外标准供试品,通过评价4条可能的分析谱带,8条可能参比谱带以及2种基线法组成的48种组合,选出适合于壳聚糖脱乙酰度红外测定的最佳组合为A1560/A2920,A1560/A2880和A1655/A3430(推荐使用A1560/A2880)。测量1560cm-1和1655cm-1谱带的吸收度以第2种基线作法(即此两峰相邻的峰谷连线)为佳。脱乙酰度的测量范围几乎覆盖全程即1%~100%,后两种最佳组合的工作曲线还适用于N-丙酰化、N-丁酰化和N-己酰化等N-烷酰化壳聚糖的取代度测定。黄玲运用甲壳素在l655cm-1，l550cm-1和l310cm-1有甲壳素酰氨的特征吸收峰I、Ⅱ、和Ⅲ，1378cm-1吸收带是CH的变形振动，Ⅱ、Ⅲ的吸收峰较弱，I吸收较强，通过标准基线法用红外光谱仪测定甲壳素的脱乙酰度，方法简便、快速，重现性和回收率较高。
1.2紫外光谱(UV)
紫外光谱(ultra-violetspectrums)简称UV,是鉴定甲壳素及壳聚糖衍生物结构和性质的有效手段之一，自Austin发表N，N-二取代酰胺与氯化锂的混合溶剂是甲壳素的优良溶剂的研究报告后开展起来的。一般多糖分子结构不存在生色团，更没有共轭基团，甲壳素则是一种特殊的多糖，每个糖残基的C2位置上有一个乙酰氨基，是一个生色团，故有紫外吸收。不过，对于没生色团的天然多糖分子，如果进行适当的化学修饰，也可能在其结构上引入生色团或共轭基团，这样，只要选择到合适的溶剂，也就可以借助于紫外分光光度法进行定性和定量研究。Austin对甲壳素的紫外光谱进行研究后，认为溶剂对紫外吸收光谱的影响较为复杂，不仅导致吸收谱带的结构发生变化，而且还会影响最大吸收峰的位置。
Aiba采用乙酰氨基的220nm的紫外吸收作为高压液相色谱的紫外检测来测定壳聚糖中N-乙酰基的含量。利用锌试剂与壳聚糖或茜素红与壳聚糖在一定酸度条件下生成复合物的特异性显色反应,如应用茜素红与壳聚糖相互作用生成的复合物在530nm处产生新的吸收蜂，反应体系在422nm和530nm处吸光值变化与壳聚糖含量成线性关系，据此建立一种具有高选择性和高灵敏度的简便快速测定壳聚糖含量的分光光度法，可用于测定不同复杂供试品中微量的壳聚糖含量。而高英立等利用甲壳素类在强酸加热条件下可彻底水解,最终产物为氨基己糖,而选定氨基己糖为基准物来判定甲壳素类化合物质量。张广明等利用紫外分光光度法测定甲壳索的脱乙酰度,202.3土0.2nm作为测定波长，样品浓度在440~1100μg/mL范围内，线性关系良好(r=0.9997)，方法简便、快速、准确。李和平等通过纯净的5-氟尿嘧啶单体的紫外光谱在265nm处出现最大吸收值,而壳聚糖-5-氟尿嘧啶的紫外光谱在262nm处出现最大吸收值,说明药物键合在高分子上。另外，紫外光谱也可用于更深入细致地阐明甲壳素的溶解机理。
2核磁共振(NMR)
Falk等人最早报道降解甲壳素在10mol/LHCl溶液中的1H-NMR谱。Gagnaire等人报道N-乙酰-D-氨基葡萄糖及其二糖、甲壳素、二甲酰甲壳素和二乙酰甲壳素的13C-NMR谱以及甲酰甲壳素和乙酰甲壳素的1H-NMR谱。仰振球等以13C交叉极化魔角旋转固体核磁法(13CCP/MASNMR)对壳聚糖供试品进行表征,实现固体条件下13C核磁共振信号的高分辨观察。该技术的实现使得对难溶或交联的高分子化学结构的研究成为可能。实验结果表明,与13CCP/MASNMR法测定结果相比,在采用红外光谱法测定壳聚糖脱乙酰度时,误差较大,可能是供试品水分造成的影响。崔毅等用Vx300型核磁共振仪测定羧甲基壳聚糖的1H和13CNMR谱,在δ178.924及δ178.232处，N,O羧甲基壳聚糖的13CNMR谱图出现2个较强的吸收峰,分别为O-CH2C*OOH和NH-CH2C*OOH的化学位移。赵晓东等以CP/MASNMR法，通过测定13C的弛豫时间(T1)和旋转坐标系下1H的弛豫时间(T1Q)研究壳聚糖热处理前后的结构变化。方军等通过脉冲梯度场核磁共振技术(PFG-NMR)来考察水、乙醇和乙醇-水混合液在用硫酸交联的壳聚糖渗透汽化膜和未交联的壳聚糖渗透汽化膜中的自扩散过程，并由得到的一系列自扩散系数证明醇-水混合液在壳聚糖膜中的透过机理。
3质谱(MS)
目前还无法用质谱法直接研究多糖的结构，只能将多糖降解为低聚糖或进一步将低聚糖制备成其乙酰或甲醚化衍生物，进行质谱测定，获得糖链组成和序列等结构信息。
将甲壳素水解成N-乙酰氨基葡萄糖，再进行全乙酰化，就可直接把样品进入质谱仪，用常用的电子轰击电离法(EI)使样品分子电离，产生分子离子(M-)及一系列碎片离子，根据这些碎片离子和分子离子的质/荷比(m/z)值及它们的相对丰度比，就可以对此化合物进行鉴定和结构研究。蒋挺大采用液-固间的相转移催化技术合成6-O-苄基甲壳素和3,6-O-苄基甲壳素,将它们控制水解,制备成全乙酰化产物,进一步用质谱证明产物的结构。Lal和Hayes用热裂解气相色谱与质谱联用,用于测定壳聚糖的氨基含量。用电子轰击质谱(EI-MS)通过甲基化或乙酰基化等方法使其转变为可挥发的衍生物的方法测定糖类的结构，该法重现性好，灵敏度高，适合于糖的全甲基化、全乙酰化及完全三甲基硅烷衍生物,可得到典型的裂解模式，不仅能确定连接方式，而且可以确定每个糖环的大小，但聚合度较高的寡糖和多糖由于其衍生物挥发性和热稳定性依然很差，不适于采用EI-MS来测定。1991年，Mock等首次将MALDI法应用于碳水化台物的测定，近十年来的研究显示：MALDI-MS是一种快速、方便分析多种类型碳水化合物的技术，其最突出的优越性在于能对不经衍生化的天然糖类物质进行测定。邓慧敏等报道用MALDI-TOF-MS法对从动、植物体中提取的环状和线状寡耱以及葡聚糖进行研究测定的工作。李艾华等用自制酸性蛋白酶粗酶液降解壳聚糖，经MALDI-TOF-MS分析产物为聚合度3～6的甲壳寡糖。Sven等用MALDI-TOFMS测定甲壳素/壳聚糖的序列组成。由MALDITOF-MS具有其他方法不可替代的优势，相信会发展成为适用范围更广的测定高分子的分子量及其分布和结构的方法。另外,串联质谱(MSn)具有灵敏度高,分析过程消耗样品少且对样品纯度要求略低,分析时间及工作量少等优点,是糖类结构测定的一种更简便适合的方法。四极离子诱捕串联质谱已成功地用于分析全甲基化寡糖，快原子轰击质谱FAB-MSn及MALDI-TOF-MSn有用于分析糖类结构的报道。
4扫描电镜(SEM)
刘波等将壳聚糖呋喃甲醛吸附树脂放到放大倍数为3000倍的扫描电镜上观察，发现这种球形树脂具有均匀的球状结构，很好的球形度且粒径分布均匀，基质表面光滑无粘结物存在，并具有发达的微孔结构。喻胜飞用扫描电镜对以相转化法制备的N-乙酰化壳聚糖超滤膜进行表面形貌分析结果表明：以乙醇为致孔剂、红外蒸发干燥10min制备的多孔壳聚糖膜孔径均匀，孔隙率高。应国清等通过扫描电子显微镜(SEM)对交联壳聚糖的形态进行表征,可见表面呈蜂窝状结构，内部结构为网络状结构。张宝忠等用扫描电镜对制得的羧甲基壳聚糖/明胶共混膜进行观察比较发现，共混膜中羧甲基壳聚糖和明胶分子间存在着较强的相互作用及良好的相容性。苗晶等合成壳聚糖硫酸酯/聚砜(scs/PSF)复合纳滤膜，并采用放大倍数分别为10000×和5000×环境扫描电镜(ESEM)对滤膜的表面和断面结构进行观察，发现膜表面致密无孔，其断面最上部为厚度大约为120nm的致密活性层，中间为PSF超滤膜的致密层。李巧霞等将制得的香草醛交联的壳聚糖微囊经扫描电镜显示微囊呈圆整的球形，表面致密，内部有空隙。YueYang等通过扫描电镜对选择性氧化壳聚糖分子与二氧化氮气体进行改性的壳聚糖膜观察它的表面发现,改性膜表面粗糙，而不是光滑的壳聚糖膜并且所有抗栓试验，溶血试验和血细胞形态观察与扫描电镜显示，改性壳聚糖膜具有优良的血液相容性。
5X射线衍射(X-ray)
莫秀梅等利用X射线衍射仪，得到不同干燥温度下所得甲壳胺膜的X射线衍射图，表明随着制膜温度的升高，结晶度降低。董炎明等对合成的N-马来酰化壳聚糖(MCh)粉末进行大角度X光衍射测定并研究其结晶性的变化。陈煜等对肉桂酰壳聚糖和肉桂酰甲壳素进行广角X射线衍射的表征，结果表明壳聚糖和甲壳素酰化反应后结晶度明显降低。刘波等利用X射线衍射分析对改性得到的一种性能良好的壳聚糖呋喃甲醛吸附树脂进行研究,发现产物与CTS比较，在2θ为20o左右的一个主要结晶峰明显减弱，无定型面积相对增加，将壳聚糖制成微球后，结晶度降低。王丽娟等经XRD分析表明，采用一步包埋法制备的新型多胺基化磁性壳聚糖微球的XRD谱衍射峰位置与Fe3O4衍射峰位置非常相似，说明在多胺基化磁性壳聚糖微球制备过程中，未显著影响Fe3O4的晶体结构。邵颖等合成羧甲基交联壳聚糖树脂(C-C-CTS)并用ESCALABMK-IIX-ray对其进行表征。魏铭等用X射线衍射仪,采用CuKa射线，在40kV、30mA条件及衍射角2θ=5～50o
测定的壳聚糖/二氧化硅复合膜的衍射谱图并计算其结晶度。
6结束语
本文综述红外光谱、紫外光谱、核磁共振、质谱、扫描电子显微镜和X射线衍射对甲壳素和壳聚糖及其衍生物的官能团、结构、组成进行定性或定量分析的方法和应用。红外光谱、紫外光谱、核磁共振主要用来表征甲壳素与壳聚糖及其衍生物的化学结构;质谱、扫描电子显微镜主要用于分析甲壳素与壳聚糖及其衍生物的组成、凝聚态结构和表面结构;X射线衍射主要用于晶型结构的确定。其中，红外光谱的应用最为普遍。核磁共振和质谱可能因仪器价格较昂贵，很多单位还未购置导致实际应用相对较少。另外热分析法和色谱法也是壳聚糖及其衍生物混合体表征的重要手段，由于篇幅有限，在此不做具体介绍。随着先进技术不断应用于甲壳素及壳聚糖及其衍生物的研究，必将能获得更多空间结构的有用信息，推动甲壳素及壳聚糖研究的快速发展。
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