引言
研究已知细胞可以经过程序性死亡的过程，如凋亡(apoptosis)。近年来研究人员发现细胞的一种非程序性死亡过程，即区别于细胞程序性凋亡，一种细胞侵入另一种细胞而导致后者死亡的过程，并命名为entosis，即“Within”的希腊文。这种细胞进入其它细胞的作用(cellincellstructure)，即活细胞“钻入”另一种细胞，并且可以在其中活动，甚至可以钻出该细胞。人体内淋巴细胞抗击癌变的过程就是典型的现象，淋巴细胞在与其他细胞接触过程中会进入后者胞浆中。1864年，Eberth发现淋巴细胞钻入肠上皮细胞。1956年Humble等描述淋巴细胞侵入其他细胞并在其胞浆中活动的现象。王小宁等也系统地描述免疫细胞进出肿瘤细胞的现象，而且发现进入肿瘤细胞的淋巴细胞不但可再出来，而且可从内部杀伤肿瘤细胞。现已知淋巴细胞可伸入巨噬细胞、人或小鼠肠柱状上皮细胞、纤维母细胞、肝细胞、肌细胞等。原子力显微镜作为一种超高分辨率的形貌表征仪器，由于其样品制备简单，可在空气和液体中成像的特点，在生物学研究领域得到广泛应用。本文用原子力显微镜和倒置荧光显微镜观察人T淋巴细胞与K562肿瘤细胞的共培养过程中，2种细胞表面形貌特征变化，从细胞层面上为揭示T细胞对肿瘤细胞的杀伤机理和过程提供重要的切入点和依据。
1材料与方法
1.1主要试剂与仪器
RPMI1640培养液、Ficoll分离液、胎牛血清(均购自GibcoBRL公司)，其余试剂或溶液均为分析纯。倒置荧光显微镜(InvertedMicroscope)，NikonTU-2000。原子力显微镜(AFM),AutoProbeCPResearch,美国Thermomicroscope公司。
1.2K562细胞的复苏与培养
液氮中冻存的K562细胞复苏，以2×106/mL接种于培养瓶内，培养液为含12%新生牛血清的RPMI1640，于37℃、5%CO2孵育箱中培养，2~3天换液一次。
1.3人外周血T淋巴细胞(TLymphocyteCell,简称TC)的分离抽取健康志愿者外周静脉血，肝素抗凝，等量RPMI1640稀释，用Ficoll分离液进行密度梯度离心分离单个核细胞，接着以2000r/min的转速离心5min以去除细胞层内的血小板，之后用RPMI1640洗2~3次后加入完全培养基，在塑料培养皿上培养吸附3h后去除单核-巨噬细胞后为淋巴细胞。然后采用尼龙棉柱法分离获得T细胞。台盼兰染色证明活细胞在98%以上。用完全培养基调整细胞浓度在2.0×106。实验分组：分别培养的TL和K562细胞组，TL与K562细胞共培养组(TL与K562细胞数目比例为1∶1)。
1.4AFM成像及力曲线的测量取各组细胞,滴在新剥离的云母片上,1.5%的戊二醛固定5min。超纯水漂洗，空气中风干。将制备好的样品固定在AFM的载物台上进行扫描观察,试验采用100μm扫描器，UL20B硅探针，力常数为2.8N/m,在接触模式(tappingmode)下扫描,所得图像均以AFM自带软件(ProscanImageProcessingSoftwareVersion2.1)进行平滑处理以消除慢扫描方向上的低频噪音。数据的分析与统计均基于AFM自带软件，如细胞表面平均粗糙度(Ra)、细胞的体积、表面积等。力曲线的统计分析采用SPSS13.0软件。
2结果与分析
2.1倒置显微镜下观察淋巴细胞与K562细胞相互作用的过程对数生长期的K562细胞0.5mL(细胞数为1.0×106个)与等体积TC(细胞数为1.0×106个)混合于培养皿内，置于37℃、5%CO2培养箱共培养12h、24h、48h后，采用台盼兰染色计数细胞的数目显示，随着共陪养时间的增长，2种细胞数目之和减少(见图1)。
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同时置于倒置显微镜下观察细胞形态变化。刚开始共培养时，两类细胞均呈现强折光性，圆润饱满，细胞形态良好(见图2A)。共培养24h后，可以看到TL先是粘着在K562细胞膜然后伸入其胞浆内(见图2B)，被TL进入的K562胞体上出现发亮的隆起物，绝大多数K562细胞出现皱缩、凹陷，少数甚至完全破裂(见图2C箭头所示)，TL的折光性也有所下降，多数细胞变的扁平，细胞膜被破坏。
可看出，图2A中K562细胞与TL都饱满圆润，有较强的折光性。图2B中可以看到一个或多个
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TL贴附在或钻入K562细胞。图2C中看到2种细胞的形态总体上都出现损伤，细胞形状变的不规则，有些K562细胞完全破裂(见图2C中箭头所示)。2.2AFM对共培养前后K562细胞与TL形貌学和细胞表面纳米机械性质的表征AFM成像显示，单独培养K562细胞，呈现圆润饱满的球形，周围有伸展的伪足(见图3A)。超微结构图可以看到细胞膜呈现均匀细致的鳞片状排列(见图3B)，直径约为9~11μm，高度约4.5~5.8μm,细胞膜上颗粒粒径在1500nm左右(见图3C)。而与TL共培养48h后的K562细胞明显损伤，细胞膜出现裂痕和塌陷，局部变得光滑，细胞表面平均粗糙度下降，伪足消失，细胞表面颗粒降为400nm左右(见图3D,E,F)。推测这可能是K562细胞膜破裂，微绒毛被破坏，同时膜表面的一些受体蛋白损伤所致。随着共培养时间的延长，凹陷加深变宽形成宽2~5μm左右的空洞，内容物外泄，高度下降到2.5~3.8μm，有的细胞甚至完全碎裂(见图2C)。而相对单独培养的TL，共培养后的TL也出现细胞表面粗糙度下降，高度变低等现象。对TL攻击K562细胞的过程的AFM扫描(见图3D)可以看到K562细胞膜上有一个宽约5μm的空洞(见图3E)。由此可以推测，TL进攻K562的过程是TL先通过其表面的一些特异性识别蛋白识别并粘着在K562靶细胞膜上，然后在靶细胞膜上挖一个洞，接着进入其胞浆内将细胞破坏裂解。少数TL甚至可以再从靶细胞内出来，多数情况是二者“同归于尽”。
3讨论
T淋巴细胞在免疫系统中发挥着重要作用，但一直没能从细胞层面观察到被激活的T淋巴细胞
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攻击的过程。AlexandreBoissonnas等利用双光子显微镜拍摄下T淋巴细胞识别致病细胞、包围并攻击致病细胞的整个过程。他们的研究还进一步证明，对肿瘤抗原的识别决定T淋巴细胞的行为。T淋巴细胞表面携带的特异性的膜受体可与病理细胞上的抗原形成互补，进而对其识别、清除。抗原可经过递呈而激活T淋巴细胞，激活的T淋巴细胞可特异地识别感染因子及肿瘤细胞，并释放出特殊的酶来杀死致病细胞。本文采用倒置显微镜和AFM对共培养不同时间段的TL细胞和K562细胞的分析显示，共培养后的T细胞，细胞表面平均粗糙度和细胞高度明显增大，而K562细胞表面则出现多个空洞，有的甚至完全破裂溶解。这是由于TL进攻K562肿瘤细胞的过程中，在肿瘤细胞的刺激下发生活化，从而释放出多种介质和因子如穿孔素等。当TL与瘤细胞相结合时，TL即把含有穿孔素的颗粒从细胞中排出，穿孔素即从颗粒中释放出来，多个穿孔素分子在瘤细胞膜聚集，从而将瘤细胞膜穿出很多孔洞，最后甚至将细胞溶解。人类机体的免疫系统有时很难将肿瘤有效地清除。因此，了解T淋巴细胞整个杀伤过程的机理，对于提高免疫系统杀灭肿瘤的效率，推广抗肿瘤免疫治疗在临床的应用具有很大的推动作用。
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