苦参是常用中药之一，具有清热燥湿、祛风杀虫、利尿之功效，为临床常用中药，用于热痢，便血，黄疸尿闭，赤白带下，阴肿阴痒，湿疹，皮肤瘙痒疥癣麻风;外治滴虫性阴道炎。苦参植物中主要含有生物碱、挥发油、黄酮类化合物和脂肪酸。其中生物碱类的主要药效成分苦参碱和氧化苦参碱具有抗肿瘤、抗肝纤维化、抗乙肝病毒、对异常肝细胞凋亡的阻断、平喘和抑菌作用。高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)是中药质量控制研究中的常用方法，应用HPLC法测定苦参中苦参碱和氧化苦参碱的含量已有报道，田娟等和汪文来等分别用高效液相色谱法测定不同产地的苦参中苦参碱和氧化苦参碱的含量，灵敏度较高，操作简单，但是杂质干扰较大。为较好地控制该品种的质量，本文参考《中国药典》方法，对样品处理方法和色谱分离系统进行优化，建立高效液相色谱法测定苦参药材中苦参碱和氧化苦参碱含量的方法，本方法简便，快速、重现性好，样品分离度好。
1实验部分
1.1仪器与试药
Agilent1200Series高效液相谱仪(美国Agilent公司);苦参碱对照品(批号:110805-200507)与氧化苦参碱对照品(批号:1100780-200405)均为中国药品生物制品检定所提供;苦参药材购于同仁堂药店，产地山西;乙腈为色谱纯，水为超纯水;其余试剂均为分析纯。
1.2色谱条件
色谱柱：AichromNH2(250×4.6mm,5μm)，流动相：乙腈-乙醇-3%磷酸溶液(80∶10∶10)，流速：1.0mL/min，检测波长：210nm，进样量为10μL，柱温:30℃，色谱图(见图1)。
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1.3对照品溶液的制备
准确称取苦参碱和氧化苦参碱各5.0mg，分别置于5mL容量瓶中，加乙腈-乙醇-3%磷酸溶液(80∶10∶10)，制成浓度为1.0mg/mL的对照品溶液。
1.4供试品溶液的制备
取苦参药材，剪碎，准确称取5.1g，加入40mL70%乙醇，90℃恒温水浴提取2次，每次2h，合并提取液，过滤待用。准确移取提取液1mL，通过中性氧化铝柱(100～200目，2g，内径1cm)，依次以三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇(7∶3)各4mL洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干后，加乙醇适量使溶解，并转移至25mL容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。进样前用微孔滤膜(0.45μm)过滤。
1.5浓度曲线测定
准确移取苦参碱和氧化苦参碱的对照品储备溶液，用流动相稀释，分别制成浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL、8.0μg/mL、10.0μg/mL苦参碱和氧化苦参碱的对照品溶液，进样测定。以峰面积为纵坐标，苦参碱和氧化苦参碱浓度为横坐标作标准曲线，并得到苦参碱的回归方程为:Y=26.326X+0.0579，r=0.9998;氧化苦参碱的回归方程为：Y=11.653X–3.112，r=0.9997。表明苦参碱和氧化苦参碱在0.5~10μg/mL质量浓度范围内有良好线性关系。以信噪比S/N=3计算方法检出限，苦参碱与氧化苦参碱含量的检出限分别为0.08μg/mL和0.20μg/mL。
2结果与讨论
2.1实验条件的选择
2.1.1提取溶剂及提取方法选择考察不同浓度的30%、50%、70%的乙醇为提取溶剂进行实验，采用超声提取法(60min)、冷浸提取法(24h)、恒温水浴回流法提取苦参药材，实验发现以本方法采用的70%乙醇90℃恒温水浴提取2次，每次2h的提取效率最高(见表1)。
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2.1.2检测波长选择取苦参碱和氧化苦参碱对照品乙醇溶液，在200~500nm进行扫描，结果均在200nm附近有最大吸收。但流动相的吸收随着波长减少而增加，杂质峰也相应增加，且短波长时，数据波动大，测定结果的重现性差，综合各因素考虑选择210nm为其检测波长较佳。
2.1.3流动相选择分别选用不同比例的乙腈-乙醇-3%磷酸溶液、甲醇-乙醇-3%磷酸溶液、甲醇-乙醇-1%乙酸、乙腈-乙醇-1%乙酸、甲醇-水-0.1%三乙胺等为流动相考察分离效果，实验发现以乙腈-乙醇-3%磷酸溶液(80∶10∶10)为流动相效果最好，待测成分峰形对称，其他成分对测定无干扰。
2.2样品稳定性试验
取同一份供试样品溶液，分别于0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h按色谱条件测定，以苦参碱、氧化苦参碱峰面积计算，RSD分别为1.93%、1.03%，表明供试样品在24h内稳定。
2.3精密度试验
取同一批药材，准确称取6份样品，分别制备6份供试溶液，按上述方法平行测定苦参碱、氧化苦参碱含量(见表2)，RSD分别为1.71%、1.55%(n=6)，表明本方法精密度较好。
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2.4重现性试验
由不同的人员，按上述样品制备方法及色谱条件，重复测定同一批样品6次，结果苦参碱、氧化苦参碱的RSD分别为2.43%和1.99%(n=6)，表明本法重现性较好。
2.5回收率试验
采用加标回收法，取6份样品，准确称定，分别加入苦参碱、氧化苦参碱对照品，按样品溶液的制备方法制备待测样品，每个样品平行测定3次，取平均值，计算回收率(见表3，4)。
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2.6样品测定
取山西产苦参药材，分别制备5份样品，进样测定(见表5)。苦参中含苦参碱、氧化苦参碱的平均百分含量分别为0.082%、2.28%，RSD分别为1.80%、1.66%。
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3结论
建立高效液相色谱法测定苦参药材中苦参碱与氧化苦参碱含量的方法，样品前处理采用中性氧化铝柱预分离被测组分和杂质，以乙腈-乙醇-3%磷酸溶液(80∶10∶10)为流动相，样品中各组分能达到完全分离(见图1B)。由于标准品和样品溶液中溶剂组分不同，导致实验中样品待测组分的保留时间和标准品略有差别，经过加标实验后，确认样品色谱图中的1号峰与2号峰分别是苦参碱与氧化苦参碱(见图1C)。杂质对测定无干扰，检测结果符合药典规定，方法学考察表明，本方法简便，快速、重现性好，样品分离度好，可作为苦参药材中苦参碱与氧化苦参碱含量测定的参考方法。
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