1拉曼光谱和共焦显微拉曼光谱仪
拉曼散射起源于分子或晶体内原子之间相对位置的改变，即振动和转动，是研究分子和固体材料结构的一种重要分析手段。与其它分析手段相比较，拉曼光谱技术以其信息丰富，制样简单，对样品无损伤等独特的优点，在化学、物理学、材料学、生命科学、环境学、医药学、地质学、文物考古和公安法学等诸多领域得到广泛的应用。随着新型激光器、CCD探测器、新型高效率滤光片、共焦技术、三维自动平台等相关实验技术的发展，使得仪器操作更为简便，应用也越来越普及和广泛。显微技术与拉曼光谱仪的结合是拉曼实验技术的一次革命性突破，显微拉曼系统利用显微物镜将激光束聚焦在样品上，并利用同一物镜收集拉曼散射光，一方面减少测试所需要的样品量，另一方面也减小测量需要的激光功率，从而大大拓宽拉曼光谱技术的应用范围。更为重要的是，显微技术使得拉曼测量的空间分辨率提升到亚微米和微米尺度，从而为拉曼光谱技术引入一项崭新的实验方法，即拉曼光谱成像。把传统的单点分析扩展到对一定空间范围内的样品同时进行对比分析。
针孔共焦显微技术改善拉曼光谱空间分辨率。普通的显微拉曼系统中，整个“视场”体积内(激光腰部直径×激光穿透深度)的全部样品的拉曼信号都被探测器所收集，而在采用“针孔共焦”显微拉曼系统中，由于引入“激光焦点–共焦针孔–探测器狭缝”光学共轭系统，从而对收集散射光的样品体积进行有效筛选，去除焦点以外区域的样品信号。共焦的优势在于改善空间分辨率，从而可对样品进行“光学切片”测量。下面以HORIBAJobinYvon公司的LabRAM系列拉曼光谱仪为例介绍拉曼光谱成像技术及其应用，并特别介绍在LabRAM系列拉曼光谱仪上的新型DuoScan和SWIFT快速拉曼成像技术。
2拉曼成像技术的实验方法
2.1拉曼成像技术的基本原理受益于激光器、单色仪和弱光信号探测技术的不断进步，如今的拉曼光谱不仅能够借助于特征拉曼频率分辨微量的混和物之中的各种化学成分信息，而且可以给出其中各种成分的空间分布信息，其空间分辨率已经接近光的衍射极限，这就是拉曼成像技术。拉曼图像能够揭示样品中主要有哪些化学成分以及各成分的空间位置分布;给出样品中颗粒(聚集体)的尺寸和数目;显示出半导体材料上的应力分布以及微米尺度上的分子取向。实验中，测试样品放置在由步进电机或压电晶体驱动的自动平台上，软件控制平台在XY水平面内移动，移动步长最小可以达到0.1μm，而在Z方向运动是通过移动聚焦物镜或载物平台实现的，步长最小可达到0.1μm，移动范围只受物镜工作距离限制。如果系统中配置不限制样品空间的开放显微镜，那么水平面内的测量范围将不受任何限制。激光束经显微物镜聚焦在样品表面，光斑直径取决于所使用的物镜的数值孔径，大小约为1~2μm，设定测量范围和步长以及测量条件后，由软件控制在每个样品点采集光谱，最后软件基于这一系列光谱数据，利用不同成分特征拉曼频率的强度变化，构建出该种成分在样品上的空间分布图，这就是拉曼光谱图像。通过仔细挑选互相不重叠的特征拉曼峰，样品中各种不同成分的空间分布可以独立地绘制图像，这种成像方式可以充分利用共焦系统的空间滤波特性。
但是拉曼成像测量中获得的样品信息量和总采集时间之间存在着不可兼顾的矛盾，要获得更多信息，必然需要测量更多点的光谱，从而必然导致采集时间的延长。这一矛盾限制对样品进行较大面积范围的拉曼成像测量。例如对样品上30×30μm范围进行光谱成像测量时，如果步长选择3μm，需要测量100条光谱，而步长为1μm时就要测量900条光谱，因而需要9倍的测量时间。特别需要注意的是如果测量步长大于实验关注对象的尺寸时，关注对象可能位于两个测样点之间，从而导致信息丢失，例如，拉曼成像测量过程中步长设为3μm，而激光光斑只有1μm，两个测量点之间有2μm的区域没有被激光覆盖。此时如果测量对象是纳米尺度的碳管，则很可能因为碳管位于两个测量点之间而不能被发现。因而拉曼成像方法的应用局限在亚微米尺度。
解决上述矛盾的一种方式是采用“线扫描”成像，利用一组激光扫描装置使光斑沿着一条X方向的直线的形式聚焦在样品表面，这个线状光斑成像在光谱仪的入射狭缝上，从而整个线状光斑辐照范围内各样品点上的拉曼散射光成像在不同的CCD像元上，同时收集多条光谱，再通过样品沿Y方向的移动就可以获得一定面积内全部样品的拉曼图像。线扫描模式的优势在于它仅用很小的成本就很大程度上提高测量速度，并且由于激光功率分布在一条线上，从而减小样品热分解或光化学反应的可能。但其缺点也是明显的，线扫描只限于可见光激发，样品表面必须是平整的，该模式下未能充分利用系统的共焦性能。也有采用柱面镜代替扫描装置聚焦激光的系统，显然由于激光光强呈高斯分布，这种配置无法避免线光斑上功率不均匀的问题。
2.2拉曼成像新技术DuoScan和SWIFT
HORIBAJobinYvon公司最新推出DuoScan和SWIFT快速拉曼成像技术，其特有的创新性光路、探测器和控制软件能够以前所未有的高速度提供真正共焦拉曼图像，使得利用拉曼光谱进行化学成像的能力不再受限于很长的信号采集时间，且同时保持单点测量所拥有的真正共焦性能。
2.2.1DuoScanDuoScan是一种全新的成像技术，通过两面可高速转动的反射镜控制激光束在样品表面以用户选择的模式扫描，从而创建拉曼图像。图1是DuoScan成像的光路原理图。
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DuoScan有3种工作模式：(1)平均模式：用户根据样品情况选定测量区域(1~300μm，方形、圆形或任意形状)，通过两面反射镜的高频转动使得激光光点在样品上快速、连续地扫描，等价于一个大面积的光斑，从而获得该区域所有成分的平均光谱，适合光敏感生物样品的拉曼成像。(2)逐点模式：预先在样品上选定一个区域，然后在此区域内进行精细的逐点扫描(最小步长可低至50nm)，从而构建出拉曼图像，适合亚微米尺度的化学成像。
(3)大范围扫描模式：采用大光斑，借助于自动平台的移动，对较大样品进行全覆盖扫描，在整个样品表面记录光谱并构建拉曼图像，实现样品表面无信息遗漏。这种模式特别适用于组分分布分析或者定位衬底上的污染物、纳米材料等小尺寸对象。无论很小或者很大的样品区域，都可以采用DuoScan模式进行快速、均匀的扫描，因为扫描步长可低至50nm，所以拉曼成像由亚微米尺度扩展到宏观大尺度。该模式不使用透镜之类光学元件，工作光谱范围220～1600nm，因而适合从紫外到近红外范围任何激发光。在DuoScan的所有模式下，拉曼光信号都保持在共焦光轴上，因而测量结果保持很好的共焦特性，共焦图像的生成变得更快速、更容易，也更加灵活多样。
2.2.2SWIFTSWIFT(ScanningWithIncrediblyFastTimes)意味着“难以置信的快速扫描”。通常，每个样品点数据采集时间不能小于500ms，但是采用SWIFT模式新型数据采集方法可以把这个时间降低到小于5ms，因而该模式适用的样品只能是那些信号非常强，能够在很短时间内采集到足够信号。
图2显示SWIFT模式的工作原理，实验中始终保持CCD探测器前的快门打开，在自动平台沿着一条直线快速移动的同时同步采集拉曼信号，该方法能保持拉曼系统的真正共焦性能。
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3拉曼成像技术的应用实例
3.1拉曼成像研究药物片剂中活性组分分布药物学研究表明，药物片剂的药效不仅取决于药物的化学浓度，其颗粒大小、结晶度以及各成分在片剂中的分布等物理性质对药物的稳定性均有很大的影响。因此在药物配方和加工过程中，控制药剂的物理特性就显得至关重要。拉曼光谱可以快速、无损伤地测定固体药剂中活性组分、配剂及赋形剂的颗粒大小及分布，成为药物片剂分析的良好工具。在LabRAMHR800光谱仪上用DuoScan技术分析一片直径约为12.5mm药片，激发波长514.5nm，首先在大范围扫描模式下对整个药片成像，每取样点(光斑)尺寸为100×100μm2，测量用时10min。然后对左上矩形小区域逐点扫描成像,每取样点尺寸为1×1μm2，用时共150min。图3中是根据各取样点的拉曼光谱生成的拉曼图像，浅色部分对应于纤维素组分，深色对应于硬脂酸镁组分。
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药片的拉曼图像说明超级快速光谱图像所具有的本领。共焦拉曼图像能够给出在样品内不同组分的空间分布以及局部浓度等。由于生成这样一个图像需要约40000条拉曼光谱，所以在进行这样的分析时，速度是至关重要的。DuoScan和SWIFT最大程度提高采集速度，并且没有以损失拉曼光谱数据为代价。
3.2拉曼成像研究单晶硅表面上的单根碳纳米管碳纳米管是重要具有优异的物理和化学性质，是一种具有重要的应用前景的新型材料。拉曼光谱一直是研究碳纳米管结构和性质的重要实验分析手段之一。单壁碳纳米管拉曼光谱的特征峰主要是180cm-1附近的呼吸振动模(radicalbreathingmode,RBM)、1300cm-1附近的与杂质和缺陷相关的D模以及1580cm-1附近的正切拉伸G模。研究表明G模的线型和位置可以用来分辨金属性和半导体性单壁碳纳米管。
实验测试样品是分布在单晶硅表面上的一些单根的碳纳米管，使用LabRAMHR800光谱仪，激发波长514.5nm，50倍物镜。首先获得样品的白光显微像(见图4a)，从中无法找到碳纳米管的存在;再用DuoScan的大范围扫描模式对图4a中所示矩形区域(1.2×0.6mm2)进行快速拉曼成像分析，光斑尺寸30×30μm2，样品上共有约800个取样点。每点积分100ms获得拉曼光谱，图4b是其中一点测到的拉曼光谱，可以看到单晶硅和碳纳米管的特征拉曼峰，图4c是整个区域的拉曼成像结果。根据特征拉曼频率很容易地找到两根不同的碳纳米管。然后再对其中一根碳纳米管所在位置(见图4c中矩形区域)进行精细的逐点扫描，步长0.5μm，光斑尺寸1×1μm2，拉曼成像结果(见图4d)，图中清晰地显示出单根碳纳米管所在。实验结果再次表明，DuoScan拉曼成像技术既可以快速容易地找到宏观区域内微量污染物的存在，又可以对污染物进行准确地定位。
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4结论和展望
拉曼成像是拉曼光谱分析方法新的拓展，具有重要应用价值。DuoScan和SWIFT成像技术特有的创新性光路、探测器和软件组合能够以前所未有的速度提供真正共焦拉曼图像。随着激光技术和信号探测技术发展，拉曼成像技术也在不断地改进和完善，新的实验技术一方面将使得测量变得更加高速快捷，另一方面能够给出更加丰富的样品信息。
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