前言
长期以来，对中药品质的评价标准是建立在其指标成分的含量之上的。如果在此种思想指导下进行研究，需要对样品进行分离、提取、纯化等繁杂的处理，弄清其各种成分的药理作用，明确构效关系，从而找出一个或两个被认为是最有效的活性成分作为药材或复方制剂的指标成分，然后以其含量高低作为中药质量的判定准则。然而，中药是化学组分极其复杂的混合物体系，一种或两种活性成分往往不能正确反映中药的整体疗效。按照传统的研究模式，将每个化学组分与主治功能进行一一对应几乎是不可能的。为此，中药材及其制剂的整体分析和质量控制成为必然的发展趋势。
红外光谱法是鉴别化合物和确定分子结构的常用手段之一。许多国家药典都采用红外光谱“指纹”特性，即微观特性作为纯药物鉴定基本工具。然而中药材、中药饮片和中成药都是远比单一组分药复杂得多的混合物体系，各种成分谱图叠加在一起，使中药红外光谱解析一直被认为是无法克服的难题。随着计算机技术的飞速发展和傅立叶变换红外光谱仪的不断革新，红外光谱法被广泛地应用于多学科领域。20世纪90年代早期，曾相继出现过红外光谱法鉴别中药的某些报道，但由于光谱总体解析知识的贫乏，其进展并不显著。此后10多年来，一系列实验结果令人信服地表明：现代红外光谱技术将中药学与分析化学等相结合,实现优势互补，无疑会在中药的宏观质量控制中扮演一个重要的角色。针对中药这一复杂体系分析的特殊性，提出“红外光谱宏观指纹鉴定法”。
1红外光谱宏观指纹鉴定法
“红外光谱宏观指纹鉴定法”的基本思想：根据混合物的红外光谱对其进行整体成分结构鉴定，使用具有相应分辨能力的谱图解析技术对不同类别的混合物进行鉴别分析。具体的分析方法包括混合物红外光谱的宏观指纹特征提取、具有更高分辨率的二阶导数红外光谱法和二维相关红外光谱分析法(这三者构成“红外光谱三级鉴定体系”)，以及基于混合物红外光谱的模式识别和多元校正等多种化学计量学方法。“红外光谱宏观指纹分析法”不仅强调对混合物的整体进行分析与鉴别的同时，也关注于某些特定成分的分析，从而实现整体分析与具体成分分析相结合的综合分析。当特定成分在混合物中具有一定的含量时，可以根据红外光谱对其进行定性分析，还可以借助多元校正的方法实现定量分析。各种模式识别方法的引入，为使用红外光谱对混合物进行鉴别分析提供更为系统有效的途径。三级鉴定具体分为3个步骤，首先是采集各种样品的红外光谱图，这些样品包括来自不同产区、不同产地、不同生态环境、不同生长期的中药材;不同厂家，不同批次的配方颗粒和中药制剂。在逐步累积红外光谱图的基础上，建立相应的图谱分类数据库。目前已建立包含约25000张谱图的数据库，将被测样本与已知图谱进行比对，按其相关性进行分析与鉴定，被称为一级鉴定。倘若相关性不足以作出确切的判断时，或需进一步进行方法间佐证时，则需要采用高分辨的二阶导数谱，进行样本和对应已知图谱的比对分析，按其相关性的量化值加以鉴定。倘若这两级分析仍未能作出准确的判断时，则需进行第三级鉴定，即采用二维相关光谱图进行分析与鉴定。对试样施加热微扰(也可以是其它的微扰)，在特定的温度区间(一般从室温到120℃)，等间隔地顺序升温，将所得到的一系列不同温度下的红外光谱经相关分析即得到二维相关红外光谱。宏观指纹光谱鉴定法的特点主要分为四个方面。(1)宏观指纹性。中药是极其复杂的混合物，它的红外光谱反映其各个组分中所含相应各种官能团在特定区域呈现的叠加谱。不同中药的光谱峰位、峰形、峰强度及其总貌构成它们自己特有的指纹性，称作为中药光谱的“宏观指纹”。根据宏观指纹的差异性，可以进行中药的分析与鉴定。(2)不失原本性并保持原有配伍性。中药材样品无需分离，所以其每一个组分的质与量不因预处理过程而发生变化。(3)快速简便。红外光谱仪器通用，操作简便，易推广应用，其结果的重复性很好。由于无需对样品进行分离提取，对单个样品的分析仅仅花费几分钟即可完成，而且可以避免在其它分析方法中寻找指标化合物的困难。(4)定量分析。利用HPLC、GC等方法给出的定量数据与化学计量学方法，可以根据未知样品红外光谱得到其特定组分的含量。
本方法的完善尚需以下两个方面的长期大量的工作。
(1)更全面地收集中药样本，获得各种药材的红外光谱图，构建更加完整的中药红外光谱数据库，以便能获得更精细和准确的鉴定识别结果。
(2)与其他分析方法相结合，由色谱、质谱等方法获取中药组分的微观信息，与红外光谱的整体解析结果相互补充。
简言之，“红外光谱宏观指纹鉴定法”是快速、简便、客观的中药分析方法。近年来，已经利用该方法在中药鉴别与质量控制方面做大量的研究。以下将对部分内容进行详细的阐述。
2红外光谱宏观指纹鉴定法的应用
2.1中药材的红外光谱分析与鉴定
2.1.1中药材主体成分的红外光谱分类中药材可按其所含的主要化学成分，如油脂、蛋白质、蔗糖和淀粉等来分类。图1是几种不同种类中药的红外光谱，它清楚地说明每一种药材呈现具有自己特有的主要化学组分及其特征功能团。脂肪的亚甲基反对称与对称伸缩振动吸收峰出现在2920cm-1与2850cm-1附近，其脂羰基的C=O伸缩振动吸收在1745cm-1附近，高油脂类药材(见图1a)在这些区域有很强的吸收峰。蛋白质的特征峰酰胺I带与酰胺II带分别出现在1650cm-1与1550cm-1附近(见图1b)。糖类的C-O伸缩振动吸收表现为1200~900cm-1范围内的多个吸收峰，不同的糖具有不同的特征吸收。图1c代表含有大量蔗糖的药材，而图1d则代表含大量淀粉的药材。根据药材红外光谱特征，已对280种中药材进行分类与鉴别。
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图1火麻仁(a)、水蛭(b)、当归(c)和山药(d)的红外光谱
2.1.2动物类中药材的三级鉴定动物类药材的主体成分基本上是一致的，在红外光谱图上都具有较强的蛋白质指纹特征，但不同的动物药材同样具有各自的指纹特征。譬如鹿茸、羚羊角、全蝎、水蛭的红外光谱具有不同的指纹特征，它们的酰胺键吸收峰出现在不同位置：鹿茸在1659cm-1和1546cm-1(见图2a)，羚羊角在1657cm-1和1517cm-1(见图2b)，全蝎在1662cm-1和1531cm-1(见
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图2c），水蛭在1659cm-1和1537cm-1（见图2d）。当药材中某些成分含量较低时，需要使用二阶导数红外光谱法才能找出特征吸收峰，也就是二级鉴定。如鹿茸的二阶导数谱中可以看到957cm-1，601cm-1和561cm-1有明显的吸收峰（见图3a），此三个峰与Ca3(PO4)2的二阶导数谱峰相同（见图3b）。由于鹿茸和全蝎的红外光谱图在酰胺I带和II带位置相近，不易区分，因此可以采用二维相关光谱法对其进行鉴别。采用热微扰和相关分析，可以看到二者的同步二维相关谱的峰强度是不同的。鹿茸有两个自相关峰，分别位于1562cm-1和1635cm-1（见图4a），而全蝎则只有一个位于1624cm-1的自相关峰（见图4b）。
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2.1.3不同产地药材的三级鉴定尽管来自不同产地的同一种药材谱图的相似度很大，但借助红外光谱的三级鉴定法，仍然可以进行有效的区分。李英明等研究来自不同产域的5种西洋参样品，根据在红外谱中~1740cm-1，~1153cm-1，~1050cm-1和~1020cm-1吸收峰，二阶导数谱中1317cm-1(草酸钙)，~1052cm-1和866cm-1(淀粉)的谱峰，以及二维相关红外谱上的差异特征，便可对美国、加拿大和中国不同产地的西洋参进行初步的鉴定。
2.1.4中药材真伪的三级鉴定采用红外光谱的三级鉴定法可以较容易地进行中药材真伪的分析与鉴定。许长华等以标本馆的东阿阿胶为标准，与伪品阿胶的谱图相比对。尽管谱图较为相似，峰形不特征，但东阿阿胶酰胺I带峰在1647cm-1，而伪品阿胶的酰胺I带峰则在1657cm-1，两者相差9个波数。另外，伪品阿胶在1026cm-1处的多糖类吸收峰较强，而东阿阿胶几乎观测不到明显的特征峰，说明东阿阿胶和伪品阿胶的蛋白类和糖类化合物有很大的不同。二维相关谱也进一步佐证东阿阿胶与伪品阿胶具有明显的指纹特征。
2.2基于中药材红外光谱的模式识别
2.2.1相关系数比对法利用计算机比对软件，将15种不同科属的升麻基源植物红外光谱与正品升麻(兴安升麻为参考标准)进行比对获得相关系数。结果表明凡是属于不同科药材的图谱相关系数差别较大，低至0.392;同属不同种，相关系数低至0.8617。来自不同产区同种样品或者相同产区不同采集时间光谱差异不明显，相关系数低至0.9281。这个方法提供对药材不经过提取分离的快速准确的测定方法。
2.2.2阵列相关系数比对法借助于各种中药材粉末的红外指纹图谱，采用可视化程序设定语言VB(VisualBasic)设计红外光谱阵列相关系数比对程序，该程序包括库的查询、程序运行基本参数设置和阵列相关系数比对法等三部分。与相关系数比对法比较，此法具有很好的专一性、抗干扰性和高灵活性。譬如，根据黄芩光谱的指纹特征，将阵列相关系数1592~1005cm-1间的相关阈值均设置为0.998，其它段设为0.7，然后与库中65张不同产地的黄芩样本进行比对，该记录为山西的野生黄芩。实验证明，阵列相关系数比对法可以增强谱图的识别能力。
2.2.3主成分分析与SIMCA分类法基于黄芩的红外光谱，使用主成分分析法对15个产地69个黄芩样品进行分类与鉴定研究。根据红外谱图的宏观指纹特性，利用主成分分析法可将其区分为6个区域，其中有一个区为栽培类。这种分类结果是与传统和现代的理论的品质评价结果一致的。它紧密地反映对地理和气候条件的相关性。因此可成为客观评价黄芩质量的依据。使用SIMCA(softindependentmodelingofclassanalogy)方法，道地药的识别率达70%，其可信度超过60%。利用红外光谱或二阶导数谱，结合主成分分析法，可以区分西洋参、人参的根、胶囊，及其制品人参茶。此方法可用于非分离的，快速(约15min之内)对人参及其产品进行品质监控。根据赤芍的红外光谱同样将18个产区90个样本经主成分分析可分为6类，该结果是与所处的地理位置一致的。
2.2.4人工神经网络法采用三种不同模式的人工神经网络(ANN),即非线性-线性、线性-线性、非线性-非线性ANN,对栽培黄芩、野生黄芩和粘毛黄芩进行识别，从监督集识别结果来看，隐含层节点数为3的非线性-线性型人工神经网络的识别能力最强，其识别正确率可达97%。此外，用径向基函数人工神经网络法预测45个赤芍样本的产区，识别正确率达到97.8%。
2.2.5其他方法K-最近邻法和支持向量机相结合，可以区别来自中国4个省的269个白芷样品和来自6个省380个丹参样品，留一交叉验证准确率分别达到99%与95%。
2.3基于中药红外光谱的质量控制
2.3.1中药配方颗粒的质量控制采用红外光谱法对中药配方颗粒及其辅料进行鉴别研究。不同生产厂商的配方颗粒中所添加的辅料类型及其用量有较大的差别，不同种的配方颗粒在辅料含量较低的情况下有较明显的指纹性，而辅料含量较高时，采用差谱技术可以提高谱图的指纹性，达到中药配方颗粒一一鉴别的目的。借助于各种药用植物、动物配方颗粒谱图的宏观指纹性：①可容易快速作出分类鉴别;②可根据与原药材谱图之间的相似相关性而很方便地用于配方颗粒的质量分析;③获知不同炮制方法对药材化学成分的影响;④鉴别不同生产厂家的产品;⑤同一厂家不同批号产品的质量分析;⑥获知制粒工艺过程中所加輔料的成分与用量，从而有效地对产品的质量进行真伪优劣的鉴别与质控。
2.3.2中药饮片的质量控制中药材在不同炮制阶段都有其各自的宏观指纹特性。蔓荆子不同炮制阶段——生鲜原料、微炒、炒黄、炒棕炒焦和最终炒炭的红外光谱研究表明，在炒制过程中脂含量恒定地快速衰减，开始时总黄酮量增高，但随后下降;炒成暗棕色的蔓荆子应该具有最佳的镇痛的效果;乙醇提取不利于蔓荆子的效能以及炒炭是不适宜的。所以蔓荆子炮制过程实质上是烯烃类、多支链油脂类物质逐渐消失和较低热稳定性的黄酮类物质的热解过程。二维相关红外光谱能用于跟踪和指导蔓荆子的炒制过程，从而对炮制品的质量达到有效的控制。
系统地研究用黄酒来炮制地黄的过程。在红外光谱中，样品吸收峰从770cm-1移到777cm-1表明多糖或低聚糖的分解产生果糖，进一步转化成类黑精。在二阶导数谱中，819cm-1峰的相对强度逐渐增强。在2D-IR相关谱中，当地黄经过20h炮制时，特征峰的强度达到最大。用红外光谱宏观指纹法能解释地黄炮制过程发生的主要变化，还可以检查炮制地黄的最佳终点，对传统的感官经验“黑如漆，甜如饴”做出科学的解释。
2.3.3中药注射剂的质量控制由于大量溶剂水的存在，对注射剂的红外光谱测定可以采用衰减全反射附件，直接取溶液样品测定，然后以同条件测得的二次蒸馏水光谱作为背景获得差谱。也可将注射液样品滴加在KRS-5盐片上，在红外灯下轻微加热待溶剂挥发后样品成膜后测定。或者将注射液冷冻干燥成粉后采用压片法测定。已测定包括清开灵、复方丹参、核葵、黄芪等20种中药注射剂，同时还考察不同厂家、不同批次的产品。结果表明：①各种中药注射剂均具有其特征光谱，可以用来区分鉴别;②某些注射剂的类似性反映碳水化合物类、蛋白质类、淀粉、油脂等是载体和中药材的有效组分的基本材料。③各注射剂具有各自的特征基团。例如，反映在1000~1100cm-1的糖甙类等C-O基团伸缩振动，1560~1640cm-1的生物碱等芳香骨架伸缩振动，以及1600~1760cm-1的萜类、黄酮类等羰基伸缩振动吸收峰，可以用作鉴别的依据。也可以借助于其它多种光谱法如紫外、荧光、拉曼光谱进行直接的测定，以便相互印证、相互补充，达到无损快速鉴别。
2.4中药的稳定性检验
利用傅立叶变换红外光谱法和变温附件可实时原位跟踪物质的热稳定性。在25~250℃温度范围内，芦丁的热变性是芦丁氧化的热分解过程。在较低温度下(75℃)，芦丁的分子结构就开始发生变化，说明芦丁的稳定性较差。采用恒温加速老化和拉曼光谱法可以判断药物的稳定性，跟踪药物的分解变质过程。芦丁片恒温在100℃下不同时间的拉曼谱同样表明芦丁的热稳定性较差。
曾对11种中药注射剂进行变温实时红外光谱跟踪研究，说明中药注射剂具有不同的热稳定性。注射剂中不同成分的热稳定性也明显不同，糖类成分最易分解变化，而生物碱成分较稳定。对清开灵的跟踪表明其羟基峰变化很大，其中甙类成分比萜类黄酮类组分变化要大。加热过程中，核葵注射剂所含糖类成分明显下降而羰基成分明显增高。
注射剂变质往往是一个渐变过程。当强制老化时间不够长或变温范围不够大时，由普通的分析方法来鉴定是非常困难的。然而，可以用热微扰的二维相关分析来跟踪这种变化。对“清开灵”、“复方丹参”等的变温跟踪研究结果表明，“清开灵”在常温空气中变质的主要化学反应可能是黄酮类化合物的氧化，以及组成化合物的构象甚至结构的变化，这些变化大多与羰基和杂芳环的共轭有关。二维相关红外光谱法为研究中药注射剂变质的机理及质量控制提供一种强有力的手段。
2.5中药成分的定量分析
近红外漫反射光谱定量分析技术具有许多优点，如可采用玻璃样品池，样品不需预处理，直接快速，测试非破坏性，非污染性，费用低，可同时测定多组分。例如，利用HPLC事先确定20种玄参中2种有效成分哈巴俄苷和肉桂酸的含量。然后将20个样本分成两组，15个样本被选为训练集，其余5个样本作为验证集。用偏最小二乘法回归建立校正模型，获得模型决定系数值R2分别为0.998与0.999，而预测标准误差是1.63×10-3和4.88×10-5。类似的方法被用来分析复方芦丁片的主组分芦丁和维生素C，模型的R2值为0.998与0.999，而预测标准误差是6.7×10-3与7.4×10-3。
尽管根据近红外漫反射光谱可以进行快速无损定量分析，但由于近红外光谱的吸收峰基本只是C-H、N-H和O-H振动的倍频或合频，所给出的指纹特征并不显著。所以，有必要使用特征性更强的中红外光谱对复杂样品进行定量分析。Wu等使用红花油的中红外与近红外光谱分别用偏最小二乘法建立校正模型，对其中水杨酸甲酯、丁香酚与α-蒎烯3种成分进行定量分析。结果表明，使用两种光谱分别对3种成分所建立的6个校正模型的决定系数R2在0.985~0.999之间。在两个水杨酸甲酯模型中，近红外光谱所建模型的预测标准误差小于中红外光谱模型;但是在对丁香酚与α-蒎烯所建模型中，基于中红外光谱的模型的预测标准误差则小于近红外光谱模型。在基于中红外光谱的双黄连粉针剂成分含量研究中，分别使用1700~900cm-1和1600~900cm-1范围内的红外光谱对黄芩苷和绿原酸建立校正模型，其决定系数R2分别为0.992和0.997，验证集的平均相对误差分别为1.94%和3.43%。以上研究结果表明，使用中红外光谱不仅可以对中药进行定性分析，还可以进行快速简便的定量分析。
3结论
中药材、中药饮片和中药制剂是多种成分的混合物，其红外光谱图谱是所含各成分光谱的叠加。只要样品中所含化学成分不同，各成分含量比例不同，就会导致红外谱图差异。凭借对这些差异特征的分析，就可以根据中药的红外光谱识别其真伪优劣。从中医药的观点来看，对于指标成分的控制难以真正有效地控制中药功效。中医辩证施治用的是药味而非某个化学成分，所以中药的质量控制不能只针对某个化学成分，必须面向方剂物质群整体。另一方面，中药所含物质极其复杂，要把质量控制建立在研究清楚所有内含成分的基础上是很困难的。换句话说，需要在尚不完全清楚中药所含全体成分的情况下，实现对物质群整体的控制。在中药质控上，不应该也没有必要对中药进行逐个成分分析鉴定，而应从宏观整体上对其鉴定研究。这种从宏观整体上对中药进行质量控制的理念，也正契合“红外光谱宏观指纹分析法”对混合物进行整体分析与鉴别的思想。大量研究结果已经证明这一方法体系在中药分析领域的显著作用，为中药分析研究与质量控制提供一种快速简便合理有效的手段。
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