前言
氨基甲酸酯类农药是一种广谱杀虫、杀螨、除草剂，在上世纪70年代末便开始同有机磷、拟除虫菊酯并驾齐驱为农业常用的三大类农药，由于该类农药应用的广泛性，如使用不当，污染严重。长期食用残留该类农药超标的蔬菜，会使人体免疫力降低、导致各种疾病的产生，严重威胁人类的身体健康。农药的残留也会对自然环境产生一定的污染，而自然环境的破坏最终仍将通过食物链的传递影响人类的健康。鉴于此，国际上对氨基甲酸酯类农药在蔬菜中的残留制定了较为严格的限量要求(≤0.02mg/kg)。为保障人类的健康，同时也为满足出口检测的要求，有必要建立一种科学合理、简便、实用的检测方法。
对于氨基甲酸酯类农药的检测，文献报道的检测方法有GC-NPD、GC-MS、HPLC-VWD、HPLC-FLD、HPLC-MS等。由于该类化合物极性强，热稳定性较差，使用GC或GC-MS检测时常需采用特殊的技术或手段以达到准确测定的目的，方法复杂。尽管HPLC-紫外和HPLC-荧光检测已经被广泛接受作为氨基甲酸酯类农药残留的分析方法，但由于灵敏度和柱效的原因不适合多残留同时定性定量分析。采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定的优点在于：检测速度快、灵敏度高、选择性强，对该类农药的定性定量检测无疑是一个好的解决办法。本研究选择菠菜等4种有代表性的蔬菜产品为研究基质，建立丙酮-乙腈混合溶液提取，GPC和PSA固相萃取柱2种不同净化方法净化，UPLC-MS/MS法检测，同位素稀释法定量的一系列样品处理及测定方法。结果表明，该方法具有简便、准确、灵敏度高等特点，可满足进出口蔬菜中多种氨基甲酸酯类农药残留检测的工作需要。
1实验部分
1.1仪器与试剂
Acquity超高效液相色谱仪(美国Waters公司);QuattroPremierXE质谱仪(美国Waters公司)。19种氨基甲酸酯类农药标准品(德国Dr.Ehrenstorfer公司)。甲醇、乙腈，均为色谱纯(美国Dikma公司);标准溶液：甲醇配制标准储备液(1000mg/L)。实验用水为超纯水。
1.2样品前处理
GPC分析条件净化柱：250mm×25mm,BioBeadsS-X3;流动相：环己烷-乙酸乙酯(1+1);流速：4.7mL/min;样品定量环：5.0mL;预淋洗体积：10mL;收集时间：10～30min。称取20.0g样品，置于100mL离心管中，加入40mL丙酮-乙腈(85∶15，V/V)，调节提取液pH9~10，均质提取3min，以4000r/min离心5min，上清液转移至快速浓干管中，于35℃快速浓缩除去有机试剂。于上述溶液中加入50mL50g/LNaCl溶液，再依次用25mL、20mL、15mL二氯甲烷萃取，萃取液通过10g无水硫酸钠脱水后，于35℃快速浓缩至干，残渣用GPC流动相溶解或固相萃取柱上样液溶解，待净化。净化一：将残渣用10mLGPC流动相溶解，按上述GPC条件进行净化，合并收集液于快速浓干管中，于35℃快速浓缩至干。净化二：将残渣用2mL甲醇-二氯甲烷(1∶99，V/V)溶解，注入预处理过的PSA柱(柱中先加入10mL甲醇，再加入10mL甲醇-二氯甲烷(1∶99，V/V)充分活化)，用甲醇-二氯甲烷(1∶99，V/V)洗脱被测物，控制洗脱速度为1.0mL/min，收集7mL洗脱液于35℃浓缩至近干。以上浓缩液残渣均用1.0mL甲醇-水(2+8)溶解，过0.2μm膜，供液相色谱串联质谱仪测定。
1.3色谱条件
色谱柱：WatersC18柱(100mm×2.1mmi.d.，1.7μm);柱温：40℃;样品室温度：室温;进样体积：10μL;流速：0.2mL/min;流动相：甲醇(A)和0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(见表1)。
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1.4质谱条件
电喷雾离子源;正离子扫描方式;多反应监测模式;电离电压3.0kV;离子源温度110℃;脱溶剂气温度300℃;脱溶剂气流量500L/h;锥孔反吹气流量80L/h;驻留时间：20ms;保留时间、定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞气能量等参数(见表2)。
2结果与讨论
2.1样品基质的选择
主要根据美国食品药物管理局的农药分析手册第一卷第3版对蔬菜产品按水分、糖分含量的分类情况，并结合蔬菜的色素、辛辣成分含量及各地区出口量情况，选择并确定4种比较有代表性的蔬菜。其中，水分大于75%，糖分小于5%的蔬菜有：菠菜(色素含量较高)、黄瓜(色素含量较低)和大葱(辛辣性物质含量较高);水分>75%，糖分大于5%的蔬菜有：胡萝卜(色素含量一般)。
2.2分析条件的优化
据文献报道，氨基甲酸酯类农药色谱分离多采用C18色谱柱，本研究中采用Waters公司的C18色谱柱。氨基甲酸酯类农药易溶于甲醇，故选择甲醇和水的混合体系作为流动相。实验中比较甲醇-甲酸水溶液和甲醇-乙酸铵水溶液2种流动相体系，结果表明，氨基甲酸酯类农药在前一体系中检测灵敏度较高，且水相中甲酸含量在0.1%以上时，随甲酸含量的增大，待测氨基甲酸酯类药物的响应值无明显变化，故确定流动相体系组成为甲醇和0.1%
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的甲酸水溶液。为节省检测时间，选择梯度洗脱的模式。虽然噁虫威和克百威、乙霉威和仲丁威以及氯苯胺灵和草达灭在总离子流色谱图上没有得到有效的分离，但由于采用选择离子对，可避免相互间的干扰，进而可达到准确的定性及定量。对电离电压、锥孔电压、碰撞能量等关键质谱条件也进行仔细的优化，并比较待测氨基甲酸酯类药物在ESI+和APCI+2种电离模式测定的灵敏度，结果表明，待测物在前一模式下检测的灵敏度远远高于后者。在优化的液相色谱和质谱条件下，19种氨基甲酸酯类农药的总离子流色谱图(见图1)。
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2.3前处理条件的优化
2.3.1提取条件的确定据文献报道，氨基甲酸酯类农药的测定中采用的提取溶剂有乙腈、丙酮、乙酸乙酯及乙腈-丙酮的混合溶液等。本文从19种氨基甲酸酯类农药中按结构分类选取有代表性的9种氨基甲酸酯类农药，比较上述各种溶剂的提取效率，实验结果表明，采用乙腈-丙酮的混合溶液作为提取液，可满足同时提取待测农药(见图2)。
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2.3.2净化条件的确定虽然液质检测具有较高的选择性，可最大程度的排除样品检测的干扰。但如不对样品进行很好的净化，较多的内源性杂质同待测物一同进入仪器检测，将会干扰待测物的离子化过程，导致离子抑制，进而降低其检测灵敏度。此外，大量的杂质进入仪器，也会污染仪器，影响仪器的使用效率和使用寿命。目前，GPC和SPE净化法已经越来越多地应用于农药残留检测的样品净化。同传统的液液萃取净化和柱层析净化相比，GPC和SPE净化法具有净化效果好、可自动化批量处理净化时间短、且具有样品富集、可提高检测灵敏度等优点。本文采用这2种净化方式对样品进行净化，并对净化条件进行详细的考察。对于GPC法净化，根据分子量的大小选择部分有代表性的氨基甲酸酯类农药，将标准品以GPC流动相溶解，过柱后，分时间段收集，考察回收率，确定收集时间（见图3）。对于SPE法净化，选用二氯甲烷作为洗脱剂，加少量甲醇调节洗脱强度，实验结果表明，在洗脱液用量不变条件下，随着洗脱液中甲醇浓度(0,1.0%,2.0%)的增加，回收率提高，但洗脱下来的杂质也增多。甲醇浓度超过1.0%以后，回收率没有明显提高，但洗脱下来的杂质大大增加。故确定洗脱剂为甲醇-二氯甲烷（1∶99，V/V）。固定洗脱剂为甲醇-二氯甲烷（1∶99，V/V）不变，用9mL洗脱剂洗脱被测物，分4次收集洗脱液(3mL,2mL,2mL,2mL)，洗脱液体积达到7mL时，再进一步增加洗脱液，回收率提高不明显，故确定洗脱液用量为7mL。
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2.4方法的线性关系、回收率、精密度和检出限分别配制浓度为0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L的混合标准溶液，以标准溶液中被测组分峰面积和内标物（D6-抗蚜威）峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中被测组分浓度为横坐标绘制标准工作曲线。结果表明，线性关系良好，可满足定量分析的需要。在20.0g空白样品中，加入19种氨基甲酸酯类农药混合标准溶液，使氨基甲酸酯类农药在样品中的浓度分别为0.01mg/kg、0.05mg/kg和0.5mg/kg，按“1.2样品前处理”方法项下操作，处理后样品进仪器进行检测（见表3）。由表3中结果可以看出，添加浓度0.01~0.5mg/kg，
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GPC法净化回收率范围70.5%~95.7%，精密度范围1.63%~12.17%，PSA固相萃取柱净化回收率范围71.8%~94.9%，精密度范围2.03%~12.06%，方法的检出限均为0.01mg/kg，各方法学指标可以满足残留分析的需要。
3结论
本文选择4种有代表性的蔬菜，建立以丙酮-乙腈混合溶液(85+15)提取样品，GPC或PSA固相萃取柱净化，应用UPLC-MS-MS，以MRM模式检测，同时测定19种氨基甲酸酯类农药残留。研究表明，此方法对多种农残同时提取，同时净化，操作简便，方法实用，具有准确度高、重现性好的优点，可用于蔬菜中多种氨基甲酸酯农药残留量的分析，值得推广。
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