激光扫描共聚焦显微镜(LaserScanningConfocalMicroscope,简称LSCM)与传统显微镜相比，具有高分辨率、高灵敏度、高放大率等特点，在细胞水平上可做多种功能测量和分析，能得到真正具有三维清晰度的原色图像，同时激光扫描共聚焦显微镜可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏。随着软件开发和应用技术的不断完善，激光扫描共聚焦显微镜已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。下面以LSM510激光扫描共聚焦显微镜为例对其应用做一简单介绍。
1LSCM的基本组成及原理
激光扫描共聚焦显微镜是一种用于图像采集和分析的精密仪器。其主要由激光光源(氩离子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm，氦氖绿激光器：543nm，氦氖红激光器：633nm，半导体激光器：405nm)、显微镜光学系统、扫描装置(检测针孔光栅、分光镜、发射荧光分色器等)、检测器(高灵敏度的光电倍增管(PMT)，电压越高，则光信号转换成的电信号越强，可将荧光图像的强度按照0~255分级显示)、计算机控制系统等组成(见图1)。
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传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰；激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，标本上的被照射点发射的荧光在探测针孔处成像，而来自该点以外的任何发射荧光均被探测针孔阻挡，由探测针孔后的光电倍增管逐点接受，在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。所以照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，也就是说照明针孔与探测针孔具有共同的焦平面。在载物台上加一个微量步进马达，使载物台沿垂直方向(Z轴)上下步进移动，将样品新的一个层面移到焦平面上，这个层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光学图像，实现“光学切片”的目的,被形象地称为“显微CT”,在此基础上计算机系统自动进行三维重建。
2基本功能
(1)多荧光探针标记样品高清晰度、高分辨率图像的采集;(2)无损伤连续光学切片图像的采集—显微“CT”;(3)三维图像重建;(4)时间序列扫描：XYt、XYZt和Xt扫描，通常指共聚显微镜系统沿着时间轴对活体细胞和活体组织内被标记物变化的动态跟踪。如测细胞内Ca2+、K+、Na+等离子浓度的变化;(5)感兴趣区域的扫描;(6)定位、定量测定;(7)图像处理。
3荧光探针的选择
3.1选择荧光探针的主要步骤
(1)根据实验目的确定需要检测的目标。(2)确定可供选择的荧光探针的范围。(3)考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备要求，主要从以下几个方面考虑：荧光探针的特异性和毒性;荧光的稳定性;荧光的光谱特性;样品中多重荧光之间的相互影响：光谱交叉。(4)荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况。
3.2细胞内游离钙离子
常用的有Fluo-3、Fluo-4、Fura-2、Indo-1，最常用的是Fluo-4，能用可见激光(488nm)激发，发射峰为525nm，其乙酰羟甲基酯(AM)形式是Fluo-4AM，无荧光，为不带电荷的亲脂化合物，易于渗透脂膜进入活细胞，在胞内被非特异酯酶水解，释放出游离酸形式的荧光探针分子，此游离态也无荧光，不易漏出胞外，一旦与Ca2+结合后便形成复合物并有较强的荧光。
3.3DNA和RNA检测
主要有吖啶橙AO、碘化丙啶PI，既可标记DNA又可标记RNA。
PI不能进入完整的细胞膜，常用于检测膜损伤、细胞凋亡、细胞核定位、核酸定量等。激发波长493nm，发射波长630nm。
AO激发波长为492nm，发射波分别为530/640nm。用激光共聚焦显微镜双通道观察可见：活细胞的胞核呈黄绿色荧光，胞质呈绿色荧光;死细胞呈红色荧光。(AO与核酸的结合分为强结合方式和弱结合方式2种，强结合方式又称插入性方式，主要与DNA结合，其荧光发射峰为530nm，呈绿色荧光;弱结合方式即静电吸引结合方式，主要与RNA分子结合，其发射峰为640nm，呈红色荧光)Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI，这3种都是DNA的特异性的荧光染料，细胞毒性小特异性强。与DNA结合后都是以紫外光激发，发射明亮的蓝色荧光，分辨率高。激发波长343/345nm，发射波长480/455nm。
3.4蛋白质、酶、抗体及其他分子等的检测FITC(异硫氰酸荧光素)能够结合细胞内总蛋白质，它是检测蛋白质最常用的荧光探针，它还能广泛地结合各种特异性的配体。用488nm的激光器激发后，发出明亮的绿色荧光。光照下易淬灭，不易保存。
另一种常用的共价标记物是罗丹明，其光稳定性比FITC好。其衍生物TRITC(四甲基异硫氰基罗丹明)是常用的共价标记探针，发红色荧光。绿色荧光蛋白(GFP)已成为跟踪活组织或细胞内基因表达及蛋白质定位的标记物。该蛋白吸收光的波长最高峰在395nm处，在479nm处也有吸收峰;发射的绿色荧光波长最高峰在509nm处，在540nm处伴随有一小峰。因此内源性荧光基团受到紫外光或蓝光激发时，均可发出绿色荧光。类似于绿色荧光蛋白，目前所使用的荧光蛋白还包括蓝色荧光蛋白(BFP)，青色荧光蛋白(CFP)及黄色荧光蛋白(YFP)。
3.5膜电位
利用荧光探针在细胞膜内外的分布差异测出膜电位。根据膜电位荧光探针对膜电位变化反应速度的快慢分为：快反应探针：Di-8-ANEPPS、Di-4-ANEPPS;慢反应探针：JC1为线粒体膜电位荧光指示剂。
3.6pH值
测量细胞内pH值常用的荧光探针有BCECF和6-COFDA，这2种pH荧光探针都是荧光素的衍生物;还有SNARF系列以及DCH等pH指示剂。
3.7细胞内活性氧基
常用DCFH-DA直接测定细胞内活性氧自由基的动态变化。
3.8细胞间通讯
Confocal可用荧光光漂白恢复(FRAP)技术检测细胞缝隙连接通讯，该方法的原理是一个细胞内的荧光分子被激光漂白或淬灭，失去发光能力，而临近未被漂白细胞中的荧光分子可通过缝隙连接扩散到已被漂白的细胞中，荧光可以逐渐恢复。由于光漂白过程是不可逆的，因此可通过观察已发生荧光漂白细胞其荧光恢复过程的变化量来判断细胞缝隙连接的通讯功能。常用的荧光探针是：6-羧基荧光乙酰乙酸、CFDA、FITC。
3.9荧光能力共振转移
常用的特定荧光对有：CFP和YFP、BFP和GFP(CFP、BFP的激发波长分别与YFP和GFP的发射波长相重叠)，cy3/cy5,FITC/TRITC。
3.10细胞结构
常用的标记线粒体的荧光探针：JC-1、Rhodamine123、SPMI;标记高尔基复合体：NBDceramide、BODIPYceramide;标记内质网：Dioc6;标记溶酶体：DAMP、neutralred。
4样品要求
样品经荧光探针标记(单标、双标、三标)。固定的或活的组织。固定的或活的贴壁培养细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上。悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片。载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右。标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发。尽量去除非特异性荧光信号。封片剂多用甘油：PBS混合液(9∶1)，甘油还有抗荧光淬灭的作用。
5样品观察的一般步骤及参数选择
根据荧光探针的激发波长和发射波长，选择合适的激发波长，分光镜滤片和发射滤片。确定扫描方式：点、线、面、三维扫描(Xt、Yt、ZtXY、XZ、XYt、XZt、XYZ、XYZt)。确定扫描密度(分辨率)：256×256、512×512、1024×1024、2048×2048。选取物镜的倍数及电子放大倍数：这个条件被确定后，扫描范围即被确定，物镜的光透射率与数值孔径(NA)的4次方成正比，与物镜的放大倍数的平方成反比，因此，应尽量选择高数值孔径的物镜。根据样品的制备质量选择合适的针孔大小，若针孔的大小以AriyDisk为单位，通常将针孔设为1，如果样品的荧光标记非常弱，可适当将针孔调大。确定光切范围，即扫描样品的厚度，锁定起始位置和结束位置。给出光切的层数及取图时累计平均次数。
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