前言
目前，人们对生命现象的观察和研究己经深入到纳米尺度和单细胞、单分子水平，如何在这样一个尺度范围内获取有用的生物化学信息对分析化学的各个研究领域均提出新的要求。单分子、单细胞检测、生物芯片的开发以及纳米技术的应用逐渐成为目前现代分析化学研究的主流领域之一。可进行实时、在线、原位、活体检测的分子探针和超微型的生物传感器成为人们研究的热点与重点。在各种分子探针研究中，荧光型分子探针由于背景较低、检测灵敏度高(如荧光型分子探针的检测灵敏度为10-14mol/L，而以染色方法为基础的吸光型探针的灵敏度只有10-7mol/L)，而成为生物分子识别研究的重点。其中基于荧光能量转移原理设计的荧光分子探针由于测量方便并且易于活体检测而成为研究中的重中之重。现有的基于荧光能量转移的分子探针可分为以下三种类型:TaqMan探针，相邻探针，分子信标。
TaqMan探针的出现使得聚合酶链式反应过程的实时监测第一次得以实现，大幅度提高PCR过程的定量精度，耐热聚合酶的应用又大大降低样品受污染的可能。现在TaqMan探针已经在科学研究和临床诊断中得到广泛使用。不过这种探针有几个不足：探针的长度限制能量转移效率，荧光背景较高;采用酶外切活性，定量时受酶性能影响;探针的线性序列构型难以区别单碱基突变;相邻探针可以进行PCR定量分析，开展活体细胞内mRNA分析的实验，不过由于也是线性探针，同样不能检测单碱基突变。
分子信标是这三种探针中设计最为巧妙的探针，分子信标是个呈发夹结构的短链DNA，其环状部分是一个长度在30个碱基左右的和目标分子互补的核酸序列，发夹的两臂是序列互补的5～7个碱基对并在5'和3'端分别连有荧光基团(如四甲基罗丹明，荧光素等)和荧光熄灭基团(如二甲基对胺基偶氮苯，苯甲酸，DABCYL)。分子信标在与目标分子作用之前，荧光基团与荧光熄灭基团互相靠在一起，分子信标不发荧光。当分子信标遇到目标分子时，环状部分会进行自动识别，并与之杂交发生构象变化，由于环状部分长于臂状部分而迫使臂状结构分开恢复荧光，这一过程伴随着DNA的双螺旋结构从臂状部分转移到环状部。当然，在高pH、高温、DNA损伤等条件下会使分子信标的荧光信号增强，这也就决定分子信标的多用途性。
1分子信标的合成
分子信标的合成通常是以可控多孔玻璃(CPG)-DABCYL作为开始材料。不同发射波长的荧光基团通过C6链被共价键合在DNA分子的5'端。在合成MB中有4个重要的步骤：(1)一个多孔玻璃固态支持体用DABCYL衍生后并联到DNA分子的3'端。余下的核苷酸通过标准的核苷酸合成法合成。(2)用三苯甲基将己胺上的胺基保护，然后通过磷酸之间的聚合反应连接在分子信标的碱基序列上。(3)核苷酸水解后从多孔玻璃中除去并用反相HPLC纯化。(4)将核苷酸上的三苯甲基除去并连上荧光基团，多余的染料通过柱层析除去，低聚核苷酸再用反相HPLC纯化并收集合成的分子信标用UV、质谱以及凝胶色谱用于表征。MB在合成以后的纯化非常重要，以保证高的信噪比并获得更高的灵敏度。
分子信标的设计要根据实验需要来进行，主要需考虑茎部序列和环状序列如何排布的问题。研究表明，分子信标的茎部序列为5~7个碱基，环状序列为15~25个碱基时可以获得更高的信噪比。茎部序列中G和C的含量不能太高，否则会使分子信标的茎部非常稳定，影响和目标DNA杂交后引起的荧光增强程度。并且，由于G对荧光基团有比较强的熄灭作用，所以5'端的第一个碱基最好不要选择G。分子信标的环状序列主要是针对目标物来设计的，由于研究的主要对象核酸和蛋白质是大分子，存在扭曲等现象，因此要选择被测对象外围的碱基序列，也就是说，要选择分子信标容易接近的那一段序列。
2分子信标的应用
分子信标因其具有背景信号低、灵敏度高、特异性识别性强、操作简单以及不必与未反应的探针分离即可实时检测等优点,在短短的时间内得到迅速的发展,并已广泛地应用于实时监测聚合酶链反应、基因突变的快速分析、DNA和RNA的检测、DNA/RNA杂交的动力学研究以及DNA/蛋白质相互作用研究等。
下面简要介绍一下分子信标的一些重要应用。
2.1实时监测PCR反应
分子信标的一个重要应用就是对PCR反应的实时检测。在PCR反应体系中加入与扩增序列互补的分子信标，用荧光PCR仪监测，就可以不需要分离多余的分子信标而实时地定量测定扩增靶标的量。这说明分子信标非常适合于在PCR过程中监测DNA的增长情况。目前分子信标已经成功地运用于各种病原体的核酸检测。在核酸检测中，可以将分子信标简单地密封在PCR管中，在每个循环的退火(annealing)阶段通过荧光信号的大小监测反应的进行程度。在退火温度下，分子信标与扩增产物结合产生荧光，未结合的分子信标不发荧光，这样荧光信号随着反应循环的增加而增强，从而反映出PCR过程中扩增产物浓度的增加。由于加有分子信标的PCR管在整个反应中是密封的，因此可避免污染，且操作简单易行，检测灵敏度高。随着PCR循环数的增加以及含目的DNA的质粒拷贝数的增加，荧光强度都随之增强。此外PCR分子信标法还用来研究基因的表达水平与肿瘤发生的关系，2002年Span等应用实时荧光PCR法研究人类绒毛膜促性腺激素(hcG)的表达水平与前列腺癌发生之间的关系，结果发现hcG的表达水平与前列腺癌发生无相关性。
由于分子信标在基因突变检测中有很好的特性，因此可用于基因分型，其基本原理是设计两个具有不同环状结构的分子信标探针，一种是对野生型的等位基因有特效性，另一个对突变型的等位基因有特效性。这两种探针有两个不同的荧光团，将这两种探针和被分析物一起加入到PCR扩增管中，在PCR扩增过程中根据两个发射波长处的荧光强度判断被检测样品的基因是完全野生型，还是完全突变型，或者是杂合型。这种方法快速、简便，准确度高，具有很好的应用前景。基于分子信标的实时荧光PCR技术进行的基因突变检测可用于多种疾病的研究。
2.2分子信标在活细胞成像中的应用
在现代分子生物学以及近来的反义核酸研究中，实时监测活细胞中的反义寡核酸链与其mRNA靶链之间的杂交一直是研究中的难点之一。分子信标技术的应用可望解决这一难题，通过设计和合成与待测目标mRNA序列互补的分子信标及对照分子信标，然后用微注射法注入活体细胞，或利用包裹分子信标的脂质体使之摄入细胞，然后用激光共聚焦显微镜或荧光显微镜观察。Matsuo等利用脂质体的传输在活细胞中引入分子信标，检测到人体膈组织细胞中成纤细胞生长因子RNA。Sokol等利用微注射方法检测到人类白血病细胞K562中RNA与分子信标的杂交。Perlette等也利用微注射法引入分子信标，对单个活细胞中的RNA进行检测，并利用ICCD成像系统得到一系列反映分子信标与RNA结合的荧光图像。Cui等利用微注射法使分子信标与内源RNA杂交，结合电子显微镜技术，实现滤过性毒菌核酸在宿主细胞内的直接成像，以及脊髓灰质炎病毒正链RNA的动力学行为研究，发现随着时间延长RNA呈不同的分布形态并与宿主细胞的微管网络有关。
由于分子信标是一段核酸片段，容易被细胞内的核酸酶降解产生假阳性等缺陷，科学家经过对传统分子信标的改进，有效防止核酸或核结合蛋白的影响。
Bratu等将分子信标中每个核苷酸在核糖上的H+用氧化甲基基团取代，使得分子信标能够耐受核酸酶的降解;Mhlanga等设计骨架上含有2-O-甲基核糖核苷的分子信标并且5'端连接tRNA等。Emory医学院的Bao等针对k-ras基因和survine基因，利用双分子信标发生荧光能量转移消除干扰的方式，实现在活细胞水平上对mRNA的测定。他们还将生物素标记到分子信标上，通过键合亲和素，可以阻止探针进入细胞核内，进而实现对活细胞内mRNA的成像。以上研究结果表明，利用分子信标可以有效地实时检测活细胞中的RNA及研究RNA/DNA的杂交过程。
2.3利用多色分子信标分析基因突变、SNP、多组分同时测定
随着人类基因组计划研究进展，越来越多的证据表明基因突变在人类疾病中具有重要作用，因此基因突变的检测对疾病的预防、诊断和治疗有重要现实意义。
传统的基因变异检测方法通常都很费时、费力，需要很多重复的移液、离心、培养、分离等步骤。而建立简单、敏感、特异和快速自动化的检测方法对疾病发病机制的深入研究起着推动作用，基于分子信标基础上建立的快速检测方法的应用使研究人员从这种繁琐的工作中解脱出来，在很大程度上提高检测的效率和分析灵敏度。人们通过分子信标进行基因变异的快速检测，从而研究疾病机理及一些相应的治疗措施。Kostrikis等建立基因光谱分型检测技术，对HIV辅助受体CCR5等位基因的突变进行检测。Beinda等分别对亚甲四氢叶酸还原酶(MTHFR)的基因变异进行研究。亚甲四氢叶酸还原酶(MTHFR)的某些基因的变异和许多心血管疾病以及神经管缺陷疾病的发病有关。
分子信标探针的工作原理：在单一光源激发下，荧光发射基团可在可见光谱区发出不同波长的荧光。他们采用DABCYL作为猝灭基团连接在分子信标探针的3'端，荧光素分子作为荧光吸收基团连接在5'端中间相应位置，5'末端连接Texasred等荧光发射基团。分子信标中荧光基团与猝灭基团紧密结合，彼此共用电子，形成一个暂时的无荧光复合体，并将吸收的荧光以热能的形式散发出去。在这种复合体中，能量从荧光吸收分子传递到猝灭基团的速度远远高于由于荧光共振能量转移而引起的能量传递速度。在与目标序列结合前波长转移分子信标保持发夹结构，荧光吸收分子所吸收的能量由猝灭基团以热能的形式发射出去。然而在与目标序列结合之后，荧光吸收基团与猝灭基团分开，其所吸收的能量被传递给荧光发射基团，荧光发射基团再将能量以自己的特征波长发射荧光。
结果表明，这种波长转移分子信标探针不仅能在单一波长激发下获得较高的荧光效率，而且保持分子信标的高特异性和高灵敏度，可以有效地分辨单碱基错配的序列。这种标记方法的好处是：如果对不同分子信标探针修饰以具有不同特征发射波长的荧光发射基团，可在同一激发光下，通过检测这些特征波长的荧光强度，实现在同一体系中的多基因分析。
2.4核酸磷酸化的实时监测
核酸的磷酸化在核酸功能化过程如损伤碱基的修复、核酸代谢过程中具有重要的作用。Tang等发展一种新的核酸片段分析技术平台(NucleotideFragmentSense，NTFS)。借助NTFS技术平台，可以方便、快捷地实时监测核酸的磷酸化过程。其基本原理是：以DNA分子信标的环状序列为模板，设计两段与分子信标的环状序列互补且处于相邻位置的DNA片段，当5'端为羟基的核酸片段经过磷酸化后，可在连接酶作用下与另一片段的3'羟基连接，打开分子信标产生荧光信号，从而实现对核酸磷酸化的实时监测。利用该平台技术可进一步发展成类生理环境下研究核酸的磷酸化过程的方法，为DNA修复机制的深入研究和新药的开发提供强有力的手段。
2.5活体细胞中的mRNA测定
mRNA的分布、运动及降解在遗传控制中是非常重要的因素，迄今为止，人们对mRNA的合成过程以及其在细胞中的运动方式所知甚少。目前，在分子生物学上mRNA的检测大多采用RT-PCR方法，其基本的步骤包括：(l)组织中mRNA的提取;(2)mRNA逆转录为相应的cDNA;(3)设计合适的引物进行PCR扩增;(4)通过凝胶电泳对所扩增的DNA进行定性或半定量分析。整个步骤非常冗长并且在PCR过程中容易产生非特异性扩增。另一种方法是利用原位杂交技术检测已固定的或经过预处理的细胞中特定的mRNA。然而，mRNA在固定的细胞和活体细胞中的状态不同，固定化或预处理的过程使我们不能真正了解mRNA合成的过程以及其在细胞中的运动。因此，直接观察活体细胞中mRNA的运动尤为重要。跟踪和观察mRNA的一个有效途径是注射或转导在体外合成的RNA荧光探针，这就要求探针与mRNA的杂交后应有荧光信号的变化，否则需要将未杂交的探针洗掉。但这一步骤在活体检测中是很难实现的，所以常规的荧光探针基本上都不适用于活体细胞中mRNA的检测。
2.6分子信标在基因芯片和生物传感器中的应用分子信标背景低、灵敏度高、无需洗脱位未杂交探针的特性可以在微型探针、基因芯片上得到很好的应用。利用共价键合和亲和素/生物素法可将分子信标固定在固相载体的表面，构成DNA传感器及DNA传感器阵列。Walt将分子信标固定在二氧化硅微球上，这些微球随机分布在500μm直径的光纤束上，运用光学编码系统和荧光显微成像系统监视微球上分子信标的荧光响应，可辨认不同的目标DNA。李军等将分子信标固定在玻片表面研制DNA传感器，该传感器响应速度快、灵敏度高，可以反复使用。同时，Jin等将分子信标固定于原子力显微镜在原子力水平上对分子信标的特异识别能力进行考察，也表明分子信标具有很高的杂交特异性，可识别单个碱基突变。陆祖宏等将分子信标固定在琼脂糖膜表面，由于琼脂糖膜能较好地模拟液相环境，因此固定后的分子信标探针比固定在玻片上的具有更高的信噪比、更快的响应速度，同时能更好地区别目标DNA和错配DNA。由于分子信标本身具有荧光背景低、信噪比高、灵敏和检测过程快捷等优点，再加上固定化技术的不断进步，将在大规模基因芯片研究中得到广泛应用。
2.7分子信标在蛋白质研究中的应用
随着基因组学的发展，出现蛋白质组学，人们发现许多问题要到蛋白质中去寻找答案。这就要求人们能够对蛋白质各方面的性质加以检测。此外，人们把蛋白质和核酸联系起来，研究蛋白质和核酸之间的相互作用，这一课题已成为现代分子生物学的研究热点之一。与传统的蛋白质研究方法(如X单晶衍射、圆二色谱等技术)相比，分子信标技术具有简单、灵敏的特点，又可以实现实时检测，甚至可以用于活体检测。方晓红等以SSB(大肠杆菌结合蛋白)、组蛋白(一种双链DNA结合蛋白)、牛血清蛋白(非DNA结合蛋白)为对象研究三者对分子信标的不同影响。结果表明，分子信标能够很好地区分这三种类型的DNA结合蛋白;分子信标与SSB具有很高的亲和力，其结合引起的荧光上升与完全互补的靶相近。同时，还以分子信标作为单链DNA的模型研究单链DNA与乳酸脱氢酶(LacticDehydrogenase，LDH)的结合特性，比较5种同功酶及不同物种的LDH(LDH5)对分子信标的结合特性，并对NAD、NAD+对单链DNA与LDH结合的抑制作用加以证实。
HIVI中TRARNA分子能与HIV中的Tat特异地结合，从而抑制Tat反式激活作用的转录。为更好地了解它们相互作用的特性，Yamamoto等根据TARRNA设计一个分子信标及与其部份互补的靶。当没有Tat存在时，分子信标不与靶杂交;而有Tat蛋白存在时，分子信标的发夹打开，产生荧光。利用这种方法可对Tat蛋白的存在进行特异的检测。由于分子信标的发夹结构中环部存在单链DNA而茎部是以双链DNA的形式存在，单链或双链核酸酶的存在均能引起分子信标结构的破坏，使得荧光信号上升，因而分子信标同样适用于多种核酸酶的分析。
分子信标应用于蛋白质研究，使分子信标应用领域得到极大的发展。由于分子信标自身的优点，此类方法同传统的方法相比更加灵敏、准确、快捷，而且往往能够提供实时过程信息，这是传统研究手段无法做到的。
3结语
近年来，分子信标技术得以飞速发展，已渗透到结构和分子生物学、基因和生物技术等领域的各个方面，毫无疑问，分子信标有着广阔的应用空间。分子信标作为一种核酸探针，其最初的设计目的只是用来检测核酸，特别是用作实时荧光PCR反应的指示探针。随着对其研究的深入，分子信标被广泛应用于生物学和生物分析领域。在功能基因研究的后基因组时期，分子信标将会在基因疾病诊断、基因治疗、活细胞中RNA的检测、蛋白质的检测、生物芯片研究以及新药开发等方面得到越来越广泛的应用。
来源：《现代仪器》，转载请注明出处-仪器信息网(www.cncal.com）