引言
冬虫夏草是我国传统名贵中药，但由于其有极严格的寄生性和特殊的生长地理环境限制，产量相当稀少，难于满足国际市场的需要。近年来，采用生物发酵的方法进行虫草类似物的生产得到较快的发展。大多数虫草产品的生产厂商，把发酵菌丝体分离之后，占97%的发酵液作为废液仅作简单处理或直接排放掉，不仅造成环境污染，而且极大地浪费资源，对草菌发酵废液进行综合利用，不仅可有效保护环境，也能够显著提高生产的附加值。虫草菌发酵废液中富含虫草菌、蛋白质、氨基酸、D—甘露糖、虫草多糖等大量的有机物，其中的活性成分虫草多糖、虫草素等具有非常高的利用价值。已经发展一种虫草发酵废液中有益成分加以利用的方法，采用絮凝剂进行沉降处理，回收蛋白质、多糖等生物大分子。壳聚糖作为一种天然高分子絮凝剂，具有很强的生物活性和营养价值，良好的生物降解性、生物协调性、吸附性等特征，本文采用壳聚糖作为絮凝剂对虫草发酵废液加以沉降处理，探索沉降效果。也通过对虫草发酵废液水解液的分析，发展对复杂虫草废液中有效成分进行全分析的高效液相色谱方法。
1实验部分
1.1仪器和药品
依利特230系列高效液相色谱系统(大连依利特分析仪器有限公司)，包括：UV230+紫外-可见检测器，P230高压恒流泵，7725i进样阀(20μL
定量环)，RO230溶剂管理器，EC2006色谱数据处理工作站，HypersilC18色谱柱(250mm×4.6mmI.D.5μm);超纯水仪(Sartorious，德国)，800型离心沉淀机(上海手术器械厂)。壳聚糖购于济南海得贝海洋生物工程有限公司;乙腈(色谱纯)购自上海星可生化有限公司。磷酸二氢钾和磷酸氢二钾(上海凌峰化学试剂有限公司)，浓盐酸(国药化学试剂有限公司)均为分析纯，单糖标准品(德国Dr.Ehrenstorfer公司)。虫草背孢发酵液废液(简称虫草废液)取自浙江省湖州市某制药厂。
1.2样品预处理
取虫草发酵液废液(原液)2mL，经0.2μm水膜过滤后作为原液样品。量取原液1000mL，加入30mL(足量)预先配置好的壳聚糖絮凝剂(100mL1%乙酸溶液+1g壳聚糖)，电磁搅拌10min，静置10h。取2mL经0.2μm水膜过滤后作为上清液样品。样品冷藏保存。
取3份100mL虫草废液做水解平行实验。将样品加入到三口烧瓶中，并向每个烧瓶中加入57.8mL浓盐酸(使溶液酸浓度为6mol/L)，置于70℃水浴中冷凝回流，水解反应7h完成。每隔1h分别从每个烧瓶中取1mL反应液，经0.2μm水膜过滤后作为HPLC分析水解样品。
1.3色谱条件
流动相A：50mmol/L磷酸缓冲液(KH2PO4，K2HPO4，pH=5.8)B：含5%水的乙腈溶液;色谱柱：HypersilODSC18色谱柱(250×4.6mm);检测器：UV250nm;流速：1mL/min;进样量：20μL。
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2结果与讨论
2.1絮凝条件的优化
壳聚糖的氨基在pH值低于6.5时发生质子化，使其表现出良好的有机高分子阳离子絮凝剂特性。作为阳离子絮凝剂，当pH为4～8时，絮凝效果为最佳。此时壳聚糖高分子链上的阳离子活性基团可与虫草废液中带负电荷的胶体基团微粒相互吸引，中和微粒的表面电荷，同时也压缩胶体微粒的双电层使胶体脱稳沉淀。实验中调节虫草废液的pH到6，进行絮凝试验。
在10只烧杯中各加入100mL虫草发酵废液，并分别加入0.2mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL壳聚糖絮凝剂溶液，搅拌10min，静置3h。离心分离絮凝沉降物3mL，将上清液及沉淀分别干燥、称重(见图1)。
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由图1可以看出，随着壳聚糖浓度的增加，所产生聚合物的量也随之增加。当达到1.5mL之后，所产生沉淀的量趋于稳定，说明沉淀基本完全。综合考虑原料成本及实际生产的需要，最终壳聚糖絮凝剂的用量选择为100∶1.5。
2.2色谱分析条件的选择
采用HPLC进行虫草多糖及不同种类单糖的分析已经发展很多种方法。其中大多采用反相色谱条件进行分离，蒸发光散射检测器检测。由于糖类样品在250nm处有一定的紫外吸收，因此采用UV检测大多采用250nm。本文也采用此检测波长。考虑到发酵废液基底的复杂性，研究一系列色谱分离条件。由于样品中不仅含有生物大分子，也含有不同极性的化合物。由于大多数化合物在210nm附近又都被紫外吸收，因此，在此波长下，设定较为极端的洗脱条件下进行实验，研究虫草废液中含有的可能组分（见图2）。
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色谱条件：流动相A：超纯水B：含10%异丙醇的乙腈溶液；检测器：UV214nm；流速：1mL/min；进样量：20μL。梯度条件（见表2）
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由图2可见，样品及其复杂，以3倍基线噪声计，可以分离得到超过100个组分。其中亲水性的组分较多，几种在色谱图的前面，疏水性较强的组分不很多，且大多可以在流动相B达到50%之前出峰。由于本文主要探讨虫草废液中的多糖类物质，因此综合考虑文献中的色谱条件和预实验结果，选择1.3的色谱条件进行研究。
2.3虫草多糖的检测与组成分析
在1.3的色谱条件分别对废液原液、上清液以及不同时间的水解样品进行色谱分析，得到图3~图5的结果。
比较图1与图2，也与壳聚糖样品的色谱峰加以对比，对壳聚糖在色谱图上的位置加以确认。基于单糖在相同色谱条件下的保留时间，初步确认复杂谱图中的位置。
由于随着多糖水解反应时间的加长，其在样品中的浓度逐渐降低，而相应地，其组成单糖的含量逐渐增加。基于此，对比不同时间水解液的分离色谱图，确认多糖的位置，也进一步对其组成单糖进行定性。显然，本文所发展的色谱分离方法，在简
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单流动相梯度条件下，使得单糖、多糖及其他基底中的组分得到较好分离。对于色谱图中其他组分的确认，尚待进一步研究。
在本文中得到定性的几种单糖在250nm附近的摩尔吸光系数大致相同，因此可以采用峰面积比近似作为其在多糖中的含量比。基于水解完全后的水解产物色谱图，最后得到在虫草多糖中甘露糖、葡萄糖、半乳糖的比例近似为1∶10∶7。
3小结
壳聚糖具有多种生理功能，因此以壳聚糖进行虫草废液中絮凝沉降，沉降物无需任何加工处理，可以直接作为营养保健品，在解决环保问题的同时，增加生产的经济和社会效益。
本文所建立的虫草多糖组分研究方法，准确、方便，节省了从原液中提取出多糖和各种单糖组分的繁琐步骤，直接从原液着手，进行定性和定量分析。这种方法也可用于对其他有效活性组分的研究。
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