儿茶酚氧甲基转移酶(COMT)是一种重要的代谢酶，广泛存在于哺乳动物组织和红细胞中，以可溶和膜结两种形式存在。在中枢神经系统中，它作为代谢酶将儿茶酚结构的神经递质去活;同时对儿茶酚雌激素，儿茶酚药物以及某些致癌物质也起到代谢作用。帕金森病是一种常见的神经退行性疾病，常见于老年人，作为与帕金森病密切相关的一种酶，COMT的活性测定是研究帕金森病发病机制和治疗药物研发的重要依据。临床样本中,血液是最易得到的样品,所含红细胞中COMT的活性可直接作为帕金森病的临床诊断指标,因此建立人体红细胞COMT活性测定的方法具有重要的实践和理论意义,对帕金森病的研究起到一定的促进作用。
COMT的活性测定方法中放射性检测法对环境存在污染，荧光法需要进行衍生化的复杂操作，过程繁琐;电化学法需特殊的检测器，价格昂贵,一般实验室难以达到。对此，以3,4-二羟基苯甲酸为底物，建立高效液相紫外法检测COMT活性的分析方法，该方法简便快速,具有很强的实用性。
1实验部分
1.1仪器和试剂
Agilent1100高效液相色谱仪;Heraeus高速离心机;DK-A8恒温水浴锅;XW-80A涡旋混合器。甲醇(色谱纯);3,4-二羟基苯甲酸(Alfa公司);4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(Fluka公司);S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(Sigma公司);其余试剂为北京化工厂分析纯产品。
1.2反应原理
在Mg2+和SAM的存在下，COMT催化底物3,4-二羟基苯甲酸，生成产物4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，酶活以测定单位时间内每毫克蛋白生成的产物量表示。
[attach]50978[/attach]
1.3标准溶液的配置
4-羟基-3-甲氧基苯甲酸用50μL的DMSO溶解,配成1mg/mL储备液，用水稀释成0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL一系列标准工作液，-20℃储存备用。
1.4样品处理
1.4.1样品的制备取加入抗凝剂的血液样品4mL，4000g离心15min(4℃)，分离血浆、白细胞及红细胞,富集于离心管底部的红细胞用4倍体积冰冷的生理盐水洗涤3次，每次4000g离心15min(4℃)，洗涤后的红细胞用冰冷的超纯净水于液氮中反复冻融5次,之后以16000g离心20min(4℃)。上清即为含COMT的酶液,其蛋白浓度采用Bradford法测定。酶液-80℃储存备用。
1.4.2酶反应体系的制备在含有2mM/LMgCl2，0.2mM/LSAM，0.2mM/L3,4-二羟基苯甲酸的100mM/L磷酸钠缓冲液(pH7.8)中加入150μL提取的酶液，反应体系的总体积为500uL,涡旋振荡后于37℃孵育60min，之后加入80μL冰冷的2M/L的PCA终止反应，16000g离心15min,上清为含产物的待测样品。
1.5色谱条件
色谱柱：AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(5μm)150×4.6mm(i.d);流动相：甲醇-0.7%乙酸水溶液(23/77,V/V);检测波长：254nm;流速：1.0mL/min;进样体积：20μL;柱温25℃。
2结果与讨论
2.1样品处理方法的选择红细胞样品中含有大分子的蛋白质，它们可能会堵塞色谱柱,造成污染，降低柱效，缩短柱子的使用寿命，因此进行分析前，必须除去这些大分子物质。实验中分别采用甲醇，乙腈及高氯酸沉淀蛋白，结果表明，高氯酸除蛋白的效果优于甲醇和乙腈，故实验中采用2M的高氯酸沉淀蛋白。
[attach]50979[/attach]
[attach]50980[/attach]
2.2方法的专属性
图2为选定的色谱条件下标准品、空白红细胞样品、加标样品及红细胞样品反应体系的色谱图，在此实验条件下，产物4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的保留时间为8.39min,红细胞中的内源性物质在此时间不干扰产物的测定，红细胞样品反应体系中6.89min出现一明显的杂峰。
2.3线性关系和检出限
储备液稀释至0.5～20μg/mL的浓度范围，依照1.5的色谱条件，以峰面积为纵坐标Y，质量浓度为横坐标X进行线性回归，结果表明:线性范围在0.5~20μg/mL的范围内，两者成良好的线性关系，回归方程为Y=71.94X-6.0228,相关系数r2=0.9998,检出限0.1μg/mL(S/N=3)，线性关系在设定范围内可以满足定量要求。
2.4回收率和精密度
制备的红细胞样品，按1.4.2的方法(不加底物)取0.5μg/mL、5μg/mL、20μg/mL3个浓度进行加标回收实验，每个浓度6个平行样，计算回收率和精密度(见表1)，在0.5~20μg/mL浓度添加范围内，回收率为92%~97%，RSD小于6%。
[attach]50981[/attach]
3样品的测定
采用本法测定10例人体红细胞的COMT活性,其中男性5例,女性5例,测定结果为COMT的活性范围在0.32～0.68pmol/(mg·min)，平均值为0.51±0.22pmol/(mg·min)。
4结论
本文采用RP-HPLC法，建立人体红细胞中COMT活性的测定方法，红细胞中的内源性物质不干扰产物的测定。该法分析时间短，操作简便，达到分析测定的要求，是测定COMT活性快速有效的方法，对COMT相关疾病的研究和药物筛选具有广泛的应用价值。
来源：《现代仪器》，转载请注明出处-仪器信息网(www.cncal.com)