三聚氰胺是什么呢?它为什么会引起如此多婴儿发生肾结石呢?三聚氰胺，简称三胺,学名三氨三嗪,别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺,是一种重要的氮杂环有机化工原料,具有一定的肾毒性。因为其分子中含有大量氮元素(大约66%)，而用全氮法检测蛋白质含量时不能够区分这种“伪蛋白氮”,所以一些不法乳制品厂家或无良的奶农，为追求最大利益而不顾消费者的生命健康和安危，往产品中大量添加三聚氰胺粉以提高“蛋白质”含量。婴幼儿由于主要营养来源于奶粉，而一旦大量食用含有三聚氰胺的奶粉，三聚氰胺在婴幼儿肾部与尿酸生成结石，长期摄入三聚氰胺，甚至会造成肾衰竭和死亡。成年人长期摄入三聚氰胺，也会造成不同程度的肾损伤，因此，无论从任何层面上讲，三聚氰胺都应该被严令禁止加入到任何食品中。
目前三聚氰胺的检测方法主要集中在色谱或色谱与质谱联用技术上。目前文献报道过的方法包括GC-MS方法，离子对试剂液相色谱-紫外检测法，LC-MS法和LC-MS/MS法等，但是上述各种方法都或多或少存在一些缺陷。美国FDA推荐的GC-MS法，需要比较复杂的样品前处理和柱前衍生步骤，操作复杂，重现性相对较差，对仪器操作者要求很高，这与目前需要面对的情况相悖，因此不适宜大面积推广;而被广泛应用的离子对试剂-紫外检测法，则有其较致命的缺陷，即色谱柱寿命很短，一般寿命在三周到一个月的时间，实验室消耗过大，且一些C8色谱柱，在分析部分奶粉样品时，存在较大“假阳性”的风险，结果可能不够准确;LC-MS和LC-MS/MS方法均存在仪器购入成本过高，绝大多数中国实验室无法承受购买费用及使用费用，因此推广起来也存在较大困难。
基于上述故障原因，本实验室开发一种采用阳离子交换色谱-紫外检测的技术，对奶粉中三聚氰胺进行准确定量。本文对离子色谱-紫外检测的方法与液相色谱-串联四级杆质谱方法所对同一样品所得到的结果进行对比，结果基本一致。该方法最低检出限为0.02mg/L(溶液)或0.34mg/kg(奶粉样品)，标准曲线可跨越两个数量级以上，样品加标回收率为77%~121%，实际样品重现性RSD小于4%，用于奶粉样品中三聚氰胺的检测，结果令人满意。
1实验部分
1.1仪器与试剂
带有淋洗液自动发生装置的ICS-2000离子色谱仪(美国戴安公司)，带有PEEK检测池的VWD3100紫外检测器，Chromeleon6.8中文版色谱工作站。所用三聚氰胺为化学纯。所有用水Millipore纯水机产生的电阻率18.2MΩ/cm的去离子水。
1.2色谱条件
分离柱：DionexIonPacCS17(4mm)和Ion-PacCG17(4mm)保护柱，淋洗液自动发生装置在线产生梯度淋洗液(见表1)。紫外检测器吸收波长为240nm。淋洗液流速为1.3mL/min，进样体积为25μL。
1.3样品前处理
准确称取5.00g奶粉样品，加入80mL去离子水于烧瓶中，将烧瓶放入超声波清洗机中超声
[attach]50982[/attach]
萃取10min，加入5mL3%冰醋酸，放入0~4℃冰箱中保存20min以沉降将上清液过滤，将滤液过OnGuardRP柱后进样。
2结果与讨论
2.1检测方式的选择
本实验室曾尝试选用抑制型电导检测法和非抑制型电导检测法对三聚氰胺进行检测，但均未获得成功。三聚氰胺是一种弱碱，其pH值只有8.0，而如果使用甲烷磺酸或者硫酸作为淋洗液，其在色谱柱中可以阳离子形式存在。如果采用抑制型电导的方式进行检测，经抑制后淋洗液pH变为弱碱性，三聚氰胺将以分子形式存在，因此无法在电导检测器中产生信号;而采用非抑制型电导检测，在酸性环境下进入检测器，三聚氰胺的离解程度也比较低，且噪音较大，因此信号也非常不明显，因此，选用电导检测器对三聚氰胺进行检测，存在一定难度。本文选取三聚氰胺的经典吸收波长240nm进行检测，可以得到比较理想的灵敏度和选择性，用于处理样品的乙酸等均不会在240nm处产生较大吸收，而作为淋洗液的甲烷磺酸在240nm处也没有吸收，因此该波长适宜奶粉中三聚氰胺的分析。
2.2色谱柱的选择
本实验室曾选用C8和C18色谱柱作为固定相，分别选取10mmol/L柠檬酸+10mM辛烷磺酸钠和乙腈/水/醋酸铵作为流动相进行实验，发现C8色谱柱可以对三聚氰胺和其它干扰组分较好分离，但是据其它实验室反应，C8色谱柱在使用pH为3甚至更低的缓冲盐作为流动相时，寿命非常短，一般只有3周左右的时间，不适合长期大量的实验操作。而C18色谱柱，三聚氰胺的保留非常弱，对于实际样品而言，干扰物过多，因此无法直接用UV/Vis进行分析。
本实验室选用的IonPacCS17色谱柱，选用阳离子交换树脂作为填料，而在奶粉样品中，多数组分为阴离子或中性物质，一般不会对三聚氰胺产生干扰，另外多数阳离子物质，在240nm处不具有紫外吸收，因此该色谱柱具有较好的选择性，产生“假阳性”的几率较之C8和C18都要低。这也是本实验室最终选用该色谱柱的重要原因。
该色谱柱的使用寿命目前未见文献报道，也未有其它实验室数据，但是根据本实验室截止目前的测试结果，该色谱柱在进样300针奶粉样品后，未出现任何保留时间偏移和柱压上升的趋势，且色谱柱柱效和三聚氰胺峰型也未出现任何下降。
2.3淋洗条件的选择
三聚氰胺在pH中性条件下比较稳定，但是在强酸或强碱的环境下易水解，逐步转化为三聚氰酸，因此在选取淋洗液时，需注意淋洗液的pH不能低于2.3，否则就会出现较明显的三聚氰胺减少现象。本实验室曾经尝试用10mmol/L硫酸作为淋洗液，三聚氰胺的出峰时间较早，但是峰宽较大，且峰高灵敏度比选用低浓度硫酸或者较低浓度的甲烷磺酸时低大约60%，这是因为在硫酸浓度较高时，三聚氰胺中的氨基逐步被羟基取代，先生成三聚氰酸二酰胺，进一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸。
后曾尝试先用3mmol/LMSA进行等度淋洗，在15min时将浓度瞬时提高到30mmol/L，以期洗脱奶粉样品中较强保留物质，但发现在做阴性奶粉样品时，三聚氰胺位置出现一未知峰，会造成“假阳性”的发生。
根据三聚氰胺的性质和实验室以前分析阳离子和奶粉样品的经验，最后将梯度方法改为表1所示程序，采用该方法，10余个阴性样品(如三元等)在三聚氰胺位置均为出现“假阳性”的峰，因此可以认定该方法可靠，并选用该方法对20余个阳性样品进行检测。其中图1为某阳性样品色谱图。
[attach]50983[/attach]
2.4线性、重现性和检出限
配制三聚氰胺质量浓度为0.01mg/L，0.05mg/L，0.1mg/L，0.2mg/L，0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，10.0mg/L和0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，5.0mg/L，10.0mg/L，20.0mg/L，100.0mg/L的系列标准品溶液制作标准曲线，以标准品质量浓度(mg/L)作为横坐标(X)，以峰高(mAu)作为纵坐标(Y)，得标准曲线线性系数均为0.999以上。在0.01~2.0mg/L和0.5~100.0mg/L范围内，标准品质量浓度与峰高均具有良好的线性关系。
取0.1mg/L标准溶液，2mg/L标准溶液，阴性样品标准加入0.1mg/L溶液，阴性样品标准加入2.0mg/L溶液，阳性样品和阳性样品标准加入5mg/L溶液进行连续5次重复进样，保留时间和峰高相对标准偏差(见表2)。
[attach]50984[/attach]
将标准品溶液稀释进样,以信噪比为10(S/N=10)计算,三聚氰胺最低检出限浓度为0.02mg/L，按1.3中样品处理方法，奶粉中三聚氰胺最低检出限为0.34mg/kg。
2.5样品及加标回收率结果
对10个阳性样品及6个阴性样品进行测试，并选取其中6个阳性样品和2个阴性样品与LCMS/MS结果进行对比实验。样品结果与对比结果及加标回收率结果(见表3)。
由表3可以看出，回收率均在77.2%~120.8%之间，与质谱检测结果对比，离子色谱法基本一致。
2.6浓度计算公式
溶液样品浓度与奶粉样品浓度之间的计算公式
如下：
原样中浓度(mg/kg)={溶液样品浓度(mg/L)×}/5g×0.001g/kg
[attach]50985[/attach]
3结论
选用3%冰醋酸作为蛋白沉淀剂，并对奶粉样品进行过滤和离线固相萃取前处理步骤，选用CS17阳离子交换柱配合淋洗液自动发生装置在线产生的淋洗液对处理后样品溶液进行分离，紫外检测器进行检测，可以准确定量奶粉样品中三聚氰胺的浓度。对不同奶粉的检测结果和与质谱对比结果表明，该方法结果准确。本实验室还将继续摸索前处理方法，并对液态奶和其它奶制品的检测方法进行摸索和开发。另外，还可以通过调整流速和变化梯度曲线的方式，将整体分析时间缩短至18min左右。
来源：《现代仪器》，转载请注明出处-仪器信息网(www.cncal.com)