摘要建立毛细管气相色谱法测定苯并三唑衍生物(Tir)中有机溶剂残留量。采用DBWax毛细管色谱柱，FID检测器，二甲亚砜为溶剂，程序升温，外标法同时检测Tir原料药中甲醇、乙酸、DMF等3种有机溶剂残留量。各待测组分完全分离，线性响应良好，曲线相关系数≥0.999，检测限分别为0.4ng，2.1ng，1.0ng，精密度RSD均小于3%，平均回收率为96.0%~104.0%，方法简便灵敏，结果准确可靠，适用于Tir中有机溶剂残留量的检测。
关键词苯并三唑衍生物有机溶剂残留毛细管气相色谱法
苯并三唑衍生物(Tir)为生物还原活性物，能选择性的在肿瘤乏氧细胞内通过特种还原酶的作用，生成具有细胞毒的活性物质，增加对肿瘤细胞的杀伤作用。由于Tir在合成过程中需使用甲醇、乙酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等有机溶剂，有机溶剂对环境、人体有一定的危害，因此，为保障药物的用药安全，控制产品质量，需要进行有机溶剂残留量的研究和控制。根据2005版药典和药品注册的国际技术要求，故应对Tir中有机溶剂的残留量进行检测，采用直接进样毛细管气相色谱法，测定Tir原料药中有机残留的含量，方法简便灵敏、结果准确可靠。
1仪器与试剂
气相色谱仪：AgilentGC6820气相色谱仪，FID检测器，CerityQA-QC色谱工作站(美国Agilent公司)。Tir原料药3批(批号：080513、080605、080630，军事医学科学院提供)，甲醇、乙酸、DMF均为分析纯，溶解介质二甲亚砜(DMSO)为分析纯，经蒸馏纯化，对测定无干扰。
2色谱条件
色谱柱：DB-Wax(30m×0.45mm×0.85μm)石英毛细管色谱柱，固定相为键合交联聚乙二醇。气化室温度为210℃，检测器温度250℃，程序升温：起始温度为80℃，以30℃/min的速率升至150℃，再以10℃/min的速率升至200℃，保持7min。载气为高纯氮，流速为2.6mL/min，柱头压力为3.5psi，分流比为15∶1。
3试验与结果
3.1系统适用性试验
取甲醇、乙酸、DMF适量，用DMSO稀释进样，记录气相色谱图，同法记录空白溶剂(DMSO)的气相色谱图。在此气相色谱图条件下，各峰保留时间分别为：甲醇为2.8min，DMF为5.0min，乙酸为6.1min，溶剂DMSO为7.4min(见图1)。甲醇、乙酸、DMF均达到基线分离，溶剂DMSO对待测组分无干扰，峰形、分离度均符合要求，理论塔板数按各峰计应大于10000。
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3.2溶液的制备
3.2.1对照品溶液分别精密量取甲醇5μL、乙酸20μL、DMF10μL，置10mL量瓶中，加DMSO
稀释至刻度，摇匀，从中精密量取0.4mL置10mL量瓶中，加DMSO稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
3.2.2供试品溶液取样品300mg，精密称定，置10mL量瓶中，加DMSO溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
3.3方法学考察
3.3.1线性关系考察分别精密称取甲醇、DMF、乙酸适量，加DMSO稀释成含甲醇4.0μg/mL，7.9μg/mL,15.8μg/mL，23.7μg/mL，31.6μg/mL，39.5μg/mL;含DMF4.8μg/mL，9.5μg/mL，19.0μg/mL，28.5μg/mL，38.0μg/mL，47.5μg/mL;含乙酸21.0，42.0μg/mL，84.0μg/mL，126.0μg/mL，168.0μg/mL，210.0μg/mL的溶液备用。分别以每个组分浓度的对照品溶液1μL注入气相色谱仪，记录色谱图，以各溶液浓度Y(μg/mL)为横坐标，峰面积X(pA*s)为纵坐标进行线性回归，计算甲醇、乙酸、DMF的回归方程分别为：(1)甲醇：Y=1.58992X-0.42435(r=0.9995);(2)乙酸：Y=0.49861X-0.51707(r=0.9991);DMF：Y=1.18362X+1.02088(r=0.9982)。结果表明：甲醇在4.0~39.5μg/mL、DMF在4.8~47.5μg/mL、乙酸在21.0~210.0μg/mL浓度范围内呈较好的线性关系。
3.3.2精密度试验将对照品溶液重复进样6次，计算待测组分甲醇、乙酸、DMF峰面积的RSD，分别为2.9%，2.2%，2.0%。
3.3.3重复性试验取样品(批号：080605)6份，各约300mg，精密称定，置10mL量瓶中，加DMSO溶解并稀释至刻度，摇匀，各取1μL注入气相色谱仪测定，甲醇和乙酸峰面积的RSD分别为2.5%、3.3%，DMF未检出。
3.3.4稳定性试验取本品(批号：080605)约300mg，精密称定，置10mL量瓶中，加DMSO溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1μL，每间隔2h进样1次，测定峰面积，结果甲醇和乙酸峰面积的RSD(n=6)分别为3.1%、4.2%，DMF未检出。结果显示样品溶液在10h内稳定。
3.3.5检测限和定量限试验分别取上述3种有机溶剂适量，精密称定，以DMSO为溶剂，逐步稀释成适当浓度的溶液，在上述色谱条件下，以信噪比S/N=3计算检测限，以信噪比S/N=10计算定量限。甲醇、乙酸、DMF检测限分别为0.4ng，2.1ng，1.0ng，定量限分别为1.3ng，6.3ng，3.0ng。
3.3.6加样回收率试验取本品(批号080605)9份，各约300mg，精密称定，置10mL量瓶中，分为3组，每组3份，每组分别精密加入高、中、低3个浓度的对照品液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为加样回收液;取本品约300mg，精密称定，置10mL量瓶中，加DMSO溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。分别取加样回收液、样品液和对照品液各1μL注入气相色谱仪测定，计算回收率。样品中DMF未检出，平均回收率>96%，表明回收率良好，方法准确可靠(见表1)。
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3.3.7样品测定取3批样品(批号080513、080605、080630)各约300mg，精密称定，置10mL量瓶中,加DMSO溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液;分别吸取样品溶液和对照品溶液各1μL注入气相色谱仪，按外标法以峰面积计算其残留量。3批样品中甲醇、乙酸残留量均小于0.1%，符合药典规定的浓度限度为0.5%的要求，DMF未检出。
4结论
采用毛细管气相色谱法，以DB-WAX毛细管色谱柱分析Tir原料药中甲醇、乙酸、DMF的残留情况，样品中各组分能达到完全分离，检测结果符合药典规定的浓度限度。本法简便灵敏，结果准确可靠，适用于Tir中有机溶剂残留量的检测。顶空进样法由于可以避免将样品中难挥发性物质引入色谱柱，减少对柱子的污染而越来越受到重视。最初也曾尝试用HP7649顶空进样器，以DMSO为溶解介质在185℃温度下进行测定，结果DMF响应值偏低，重现性差，这是由于DMF挥发性太差，且沸点较高(154℃)，故不宜采用顶空进样法。对于色谱柱的选择，曾选择不同极性的毛细管柱，如DB-1、HP-5低极性柱，各溶剂峰分离度不好，峰形较差。DB-35MS中等极性柱，DMF峰形较差，重现性不好。采用DB-Wax极性柱，各峰能达到基线分离，重现性好，空白溶剂DMSO无干扰，适合于各溶剂的分离分析。
参考文献
1国家药典委员会编.中国药典·二部，北京：化学工业出版社，2005，附录:54
2周海均.药品注册的国际技术要求·质量部分，北京：人民卫生出版社，2001
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