摘要建立大鼠全血中灵芝酸单体Me的高效液相色谱测定方法。采用色谱柱Diamonsil®C18柱(250mm×4.6μm,5μm)，流动相为甲醇-水(体积比为94∶6，用醋酸调pH至3.6);流速为1mL/min;检测波长为245nm;内标为苯丙酸诺龙。灵芝酸单体Me血中浓度在0.05~40μg/mL范围内线性良好(r>0.99)，定量限为50ng/mL，日内和日间测定的精密度(以相对标准偏差表示)均低于8.6%。该方法简便、灵敏、准确，适用于大鼠体内灵芝酸的药物动力学研究。
关键词高效液相色谱法灵芝酸单体Me大鼠全血
灵芝是我国名贵的药用真菌。它可以治疗多种疾病，具有滋补强壮、扶正固本作用，有利于机体恢复或保持健康状态。灵芝酸则是从灵芝中分离得到的一类具有广泛药理活性的物质，是当今灵芝研究的又一热点。灵芝酸具有抗肿瘤、抗艾滋病毒、降血压、降血脂、镇痛等功效，是灵芝的主要有效成分。最近研究表明灵芝酸单体Me(GAMe)具有抗小鼠Lewis肺癌作用，可以通过调节IL-2和IFN-γ的表达，增强NK细胞活性，提高机体免疫水平，抑制肿瘤生长，同时，GA-Me对机体免疫有一定的调节作用。但是，目前对灵芝酸的研究报道限于质量控制、分离及药理等，血液中灵芝酸单体含量的测定方法尚未见报道。本研究以苯丙酸诺龙为内标，建立测定大鼠全血中GA-Me含量的高效液相色谱方法。
1实验部分
1.1仪器与试剂
岛津公司高效液相色谱仪，LC-10ADvp二元泵，SPD-10AVP型紫外检测器;GA-Me(纯度>99%，见图1a)由灵芝菌丝体纯化得到;内标物苯丙酸诺龙(见图1b)购于上海顺勃生物工程技术有限公司，甲醇及乙腈为色谱级，水为超纯水，其它试剂均为国产分析纯;SD大鼠购于上海西普尔-必凯动物实验有限公司。1.2溶液配制及样品处理准确称取GA-Me10mg，溶解于5mL甲醇中，混匀得到2mg/mL的GA-Me标准储备液，密封后置于-20ºC冰箱中保存备用。使用前取标准储备液加流动相配成标准工作液。
[attach]51028[/attach]
大鼠全血样品的预处理：取大鼠全血200μL，加入质量浓度为100μg/mL苯丙酸诺龙内标溶液50μL，乙腈1mL，涡旋混合1min，以8000r/min的速率离心5min。精密量取上层0.9mL，室温下用氮气流吹干。加入流动相200μL，涡旋混合1min，取20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
1.3色谱条件
色谱柱为迪马公司Diamonsil®C18(250mm×4.6μm,5μm);流动相：甲醇∶水(体积比为94∶6，用醋酸调pH至3.6);流速：1mL/min;检测波长：245nm;柱温为室温;进样量：20μL。
2结果与讨论
2.1方法的专属性
在“1.3”节所述的色谱条件下，记录空白全血、加对照品和内标的空白全血和大鼠静脉注射GA-Me后的全血样品色谱图（见图2）。由图2可知，GA-Me、内标物的保留时间分别为9.6min和7.2min，血液中的GA-Me与内标峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰。
[attach]51029[/attach]
2.2实验条件的选择
2.2.1血液样品的处理方法在血液处理方法的选择上，分别考察用三氯乙酸、氢氧化钠和乙腈去血液蛋白及药物在全血中的分布情况，实验表明GA-Me在酸性或碱性条件下易水解，为提高药物的稳定性，采用乙腈沉淀血液样品中的蛋白。GA-Me在血浆和血细胞层中的分布约是2∶1，为提高本实验方法的灵敏度，选择全血作为生物样品。
2.2.2流动相通过考察几种流动相，发现由甲醇和水(94∶6，V/V，用醋酸调pH至3.6)组成流动相为最合适的流动相，增加流动相中甲醇的比例，所有物质出峰时间提前，分析时间变短，但是内标的峰形易受血中内源物质的干拢，在流动相中加入醋酸并不会改变灵芝酸Me的保留时间，但可以获得GA-Me的对称峰形。在上述流动相条件下GA-Me保留时间为9.6min，内标物苯丙酸诺龙保留时间为7.2min，该时间非常适合于生物样品分析。
2.2.3内标物根据与被测物结构相似和保留行为相似的原则选择内标物。在实验中考察熊果酸、氢化可的松、苯丙酸诺龙等多种成分为内标物时的分离检测情况，结果在“1.3”节所述的色谱条件下苯丙酸诺龙的保留时间适当且无干扰，因此最终选择苯丙酸诺龙作为内标物。
2.3方法学评价
2.3.1标准曲线和线性范围取大鼠全血200μL，分别加入GA-Me标准品溶液50μL，得到0.05μg/mL,0.1μg/mL,0.2μg/mL,0.4μg/mL,0.8μg/mL,1.6μg/mL,3.2μg/mL,6.4μg/mL,12.8μg/mL,25.6μg/mL,40μg/mL的全血标准样品溶液。按“大鼠全血样品的预处理”项下所述方法操作后进样，记录色谱图。以待测物浓度为横坐标(X)，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标(Y)，得回归方程：Y=0.02083X-0.00052(r=0.9978)，结果表明GA-Me在0.05~40μg/mL内线性良好，最低定量浓度为50ng/mL。
2.3.2精密度与准确度在0.2mL空白全血中精密加入药品储备液适量，各制成0.05μg/mL，2μg/mL，40μg/mL3种浓度的全血标准样品，各浓度进行5个样本分析，连续测定5天，并与标准曲线的制作同时进行。以当日的标准工作曲线计算样品的质量浓度，求得方法的精密度(用相对标准偏差(RSD)表示)和准确度(用相对误差(RE)表示)(见表1)。
2.3.3相对回收率在0.2mL空白全血中精密加入药品储备液适量，各制成0.05μg/mL，2μg/mL，40μg/mL3种浓度的全血标准样品各5份，按“大鼠全血样品的预处理”项所述方法操作后进样，记录色谱图。通过标准曲线算出回收率。结果表明：低、中、高3种浓度的方法回收率分别为(95.6±8.2)%，(97.2±5.6)%和(99.4±5.0)%。
[attach]51030[/attach]
2.4稳定性试验
在0.2mL空白全血中精密加入药品储备液适量，各制成0.05μg/mL，2μg/mL，40μg/mL3种浓度的全血标准样品各10份，置于4ºC保存5min和
12h后，按“大鼠全血样品的预处理”项下所述方法操作后进样，记录色谱图。结果表明5min后样品保持稳定(RE在±7.2%之内),12h后样品水解大于25%，建议尽快处理血液样品，使药物在5min以内转移到有机相中可以保证实验结果的准确性。
2.5药物动力学研究
5只大鼠静脉给药(体重为280~300kg，给药剂量为5mg/kg)后，分别在0min,1min,3min,5min,10min,15min,30min,60min,120min,180min,240min,360min,480min,720min时从大鼠股动脉取血0.2mL，按照上述方法处理全血样品，采用HPLC方法测定GA-Me浓度，绘制得到平均血药浓度-时间曲线。采用ThermoKinetica®software(4.4版)计算程序对血药浓度-时间数据进行拟合，静脉给药时GA-Me在大鼠体内的药-时过程符合三室模型，主要药动学参数为：t1/2α:0.046±0.021(h),CL:1.17±0.11(L/h/kg),Vc:0.30±0.11(L/kg)。
3结论
本研究建立的HPLC检测方法简便、灵敏、准确，样品分析时间短，可用于大鼠体内GA-Me的含量测定，为GA-Me的药物动力学研究提供灵敏可靠的检测手段，也为灵芝酸其它单体的生物样品分析方法建立提供参考。
参考文献
1PatersonRR.Ganoderma–atherapeuticfungalbiofactory.Phytochemistry,2006,67(18):1985~2001
2TianYP,ZhangKC.PurificationandcharacteristicofproteinaseinhibitorGLPLA2fromGanodermalucidumbysubmergedfermentation.Chinesejournalofchromatoguaphy(田亚平，章色昌.色谱),2005,23(3):267~269
3LiCH,ChenPY,ChangUM,etal.GanodericacidX,alanostanoidtriterpene,inhibitstopoisomerasesandinducesapoptosisofcancercells.LifeSci,2005,77(3):252~265
4ZhuM,ChangQ,WongLK,etal.TriterpeneantioxidantsfromGanodermalucidum.PhytotherRes,1999,13(6):529~531
5El-MekkawyS,MeselhyMR,NakamuraN,etal.Anti-HIV-1andanti-HIV-1-proteasesubstancesfromGanodermalucidum.Phytochemistry,1998,49(6):1651~1657
6LiC,LiY,SunHH.Newganodericacids,bioactivetriterpenoidmetabolitesfromthemushroomGanodermalucidum.NatProdRes,2006,20(11):985~991
7WangG,LiuJW,ZhongJJ,etal.EnhancementofIL-2andIFN-gammaexpressionandNKcellsactivityinvolvedintheanti-tumoreffectofganodericacidMeinvivo.IntImmunopharmacol,2007,7(6):864~870
8TangW,LiuJW,ZhongJJ,etal.GanodericacidTfromGanodermalucidummyceliainducesmitochondriamediatedapoptosisinlungcancercells.LifeSci,2006,80(3):205~211
来源：《现代仪器》，转载请注明出处-仪器信息网(www.cncal.com)