建立浓度定标方程的实际步骤
由于样品组分的成分以及各组分的光谱特性无法预先知道，因此NIRDRS样品组分浓度的计算方程不能用解联立方程的方法，只能用一批标准样品，以多元统计的方法标定仪器得到。用组分含最已知的样品的近红外漫反射光讲，通过多元线性回归的方程来得到该组分浓度定标方程的实验步骤如下:
(1)选取一批n个样品，其中待测成分的含量预先用标准方法测出，设各样品中待侧组分含量分别为:C1C2Cn，同时侧出它们的漫反射光谱。
(2)在近红外8000--4000cm-1的光谱区内，按一定的波数间隔(△v)，将光谱分成P[P=I+(800()一4000)/Av〕个波数点，这批样品中每个样品.对每个指定的第i的波数点，都有一个确定的A值，该值与对应样品中的待测成分的浓度c构成一组数。
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(3)对这组数可用最小二乘法作线性回归得到一元线性方程:c=K0+K1A1。
(4)用各个样品的近红外光谱中的A1值代入上述回归方程中，可计算出每个样品待测成分的计算浓度C'，由此每个样品的实际浓度C与对应的计算浓度C'构成一组数:
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对这组数作线性回归可得出c与c'的相关系数与标准差[attach]51168[/attach]
(5)依次把近红外光谱中每个波数作上述第(2)一(4)步骤运算，并找出相关系数最高、标准差最小的波数点，设其相应的反射吸光度为A1(即A.与浓度‘的相关最高，而且该相关受背景成分的影响最小)，由此得到计算待测成分浓度的最佳一元回归方程
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用该波数处吸光度的一元方程计算待侧成分的浓度与实际浓度的偏差是所有一元方程中最小的。.
(6)为了使计算偏差更小，需增加标定方程的项数，可在余下的(P一1)个波数点，按上述第(2),(3),(4),(5)步骤选出另一个波数点，其相应的吸光度A2与A1组成浓度计算二元回归方程
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方程式(5一29)是所有与A1组合的二元方程中计算待测成分浓度与实际浓度间的偏差最小的方程。
(7)按上述第(2).(3),(4),(5).(6)步骤可选出更多的波数点.建立待测成分浓度计算的多元回归方程
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用这种逐步回归的方法可以选到受背景影响最小、包含待侧成分含量信息最大和能有效校正背景影响的一些波数点。用该浓度定标方程预测未知样品中组分含量时，与实际含最的偏差更小，这种用统计方法建立的浓度定标方程与普通联立方程(具有确定的解)不同，不但与标准样品组成有关，而且也与用于统计分析的标准近红外漫反射光潜(NIRDRS)有关。
(8)定标方程的评价:通过预测样品的NIR谱由定标方程计算出每个预测样品的含盆，称为样品的预测值，并用统计方法将样品含量的NIR预测值与相应的样品化学值比较，根据预测值与样品的准确值是否一致(用统计盆表示)评价定标方程。若上述两值统计结果相一致，该定标方程(或数学方法)可用于侧定未知样品。
复杂样品近红外漫反射光谱分析浓度计算方程的优化
1)确定定标方程合理的项数
如何确定选用波长的数目，即式(5一30)的项数。如果选择的波长数目少，即计算方程中的项数太少，则由于覆盖面不够，就不能把样品中的各种影响测定成分的背景因素包含在内，定标方程对待测成分的浓度也就不可靠。若波长数选得过多.会使误差E增大，而且计算量过大。这种关系见图5.9
图5.9表示用近红外漫反射光讲预测样品中某一组分时，预测值的误差ER与定标方程项数N(定标方程的复杂性)的关系。图5.9中曲线口表示样品中背景成分变化造成的ER-N关系，随着定标方程的项数，即校正背景变化的项数增加，预测误差减小;曲线b表示由于NIRDRS的测误差的叠加使预侧值的误差随之增高;曲线c为a,b两曲线的叠加，表示实际预侧误差与定标方程项数间的关系，曲线表明有一个预测误差最小的最佳值，浓度方程的项数过少或过
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多时，预测精度都会下降。一般选择3-4个波长，建立3-4元方程为宜。
2)选择适当形式的线性函数
必须选择适当形式的线性函数F，降低非线性误差E。表5.4表示建立浓度定标方程时分别用反射吸光度A,A的一次傲分dA与二次微分子d2A，用统计方法得到浓度定标方程，并用这些方程预测未知样品，得到标准差(SD)与相关系数Ro
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表5.4说明漫反射光谱线性函数以漫反射吸光度的微分和二次微分的形式作预洲未知样品时精度较高。
3)选择最佳波数点并确定相应方程中的常数和系数
建立浓度定标方程时应在NIR全谱区范围内选择最佳波数点，这些波数点包含待测成分的信息量最大，受背景干扰最小。一元浓度定标方程是指用近红外漫反射光谱一个波数点的反射吸光度值来计算样品中某一组分的浓度，一元定标方程对于样品中待侧成分的背景变化没有校正作用，因此在样品的近红外光谱中选取不同波数点的反射吸光度和组分浓度c作一元线性回归时，其相关系数与标准差不同(图5.10)
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图5.10是谷物粉末近红外光谱各波数点处反射吸光度A与蛋白质含量c间的相关系数R:与波数间的关系图。由图5.10可见R:值的极高点(即图中的峰值点)都接近蛋白质的吸收峰值，而且与背景成分的吸收峰值相差较多。R2值的极低点(即图中的谷区)，都接近样品中背景成分的吸收区。极高点与极低点R2值相差千倍以上，若与(图5.11)谷物粉末中组分b(蛋白质)的NIR讲相对照，可以对各相关指数最低点与最高点(图5.10中的谷与峰)做出合理的解释。
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若选择几个波数点建立浓度多元方程，则对于背景的变动就有校正作用，多元定标方程所选用的多个波数点中，各自单独的相关系数(图5.10)并不一定高，一般这些波数点中有1-2个是处在待侧成分的特征吸收区，而其余波数点不在待测成分的特征区，以便包含更多背景成分的信息，在最佳波数组合中起校正作用。表5.5是用最大相关系数法对最佳波数组合选择的过程。
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由表5.5选择波数的过程可见，第2,3,4次所选的三个波数点中都有两个以上在蛋白质特征吸收区内(图5.10和图5.11)，但定标方程计算结果的相关系数不是最高的，最后选出的相关系数最高的蛋白质浓度定标方程中，只有一个波数点4608cm’处于特征吸收区，其他两个波数点从图5.10、图5.11中可看到也属于蛋白质NIR吸收区，从图5.10可看到，这两个波数点受背景的影响变化较大、相关系数R很小，但这两个波数点与校正背景的变化关系更大。
5.3.3未知样品的测定
浓度定标方程已经建立后，可用于未知样品的测定，特别要注意样品的全部制备方法、装样技术、侧定的仪器参数以及温度、水分等环境条件都必须与建立定标方程时所用定标样品相同。
在这种严格条件下.测出样品的近红外光讲参数(或扫描样品的近红外光谱)，即可用定标方程、由近红外光谱参数计算出样品中指定组分的含量。
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