抗体的纯度，即抗体中杂蛋白的浓度。杂蛋白较高时，需要较高的稀释度，这样可以降低杂蛋白的影响。
孵育的时间，时间越长，所用的抗体稀释倍数越高。
组织中抗原含量对抗体的应用浓度有不同的要求。在免疫反应中，过多的抗体将导致阴性结果，这种现象类似于凝集反应中的前带现象。因此需用“方格滴定”的方法找出适当的稀释度，并得到最大强度的抗原染色和最低的背景着色。一般认为，某一稀释度下特异性染色较强且无背景着色是较理想的稀释度，加长孵育时间可有效地降低所用抗体的浓度有利于提高染色质量，节省抗体，可用37℃0.5小时或4℃过夜的方法。只要控制好温度、抗体稀释度和孵育时间，一般都能得到理想的染色效果。
还有非常需要注意的一点是稀释的时间不可太长，温度不能过高以免蛋白发生变性。