免疫组化操作流程
仪器网 · 2012-07-16 13:40 · 34380 次点击
免疫组化操作流程(PAP法、ABC法)
1.脱蜡至水:二甲苯(1)、(2)脱蜡各15min→无水乙醇(1)、(2)各5min→90%乙醇5min→水洗→PBS5min
2.抗原修复:1)微波修复:微波中高档5min3次→自然冷却至室温→PBS过一遍3次5min,
2)酶消化:0.1%胰蛋白酶37℃孵育30min→PBS5min
3.阻断内源性过氧化物酶:置3%3次5双氧水浸泡15min→PBS5min
4.封闭:10%正常二抗血清室温10min
5.一抗孵育:甩去血清后加一抗,置湿盒内4℃过夜→PBS5min3次5
3次56.二抗孵育:擦片后加二抗,置湿盒内37℃孵育30min→PBS5min
三.免疫组化操作:
1.4%多聚甲醛常规灌注固定,取材并置20%蔗糖溶液(4℃)中过夜。蜡块制作。切片,贴片。0.01MKPBS清洗5min×3后;
2.加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液(甲醇80ml+0.01MKPBS100ml+30%过氧化氢)30min,以消除内源性过氧化物酶的影响,0.01MPBS清洗5min×3;
3.加入配好的0.3%TritonX100(30%TritonX100+0.01MKPBS100ml)30min,以增加细胞的通透性,0.01MKPBS清洗5min×3;
4.加入用血清稀释液(牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS100ml+叠氮纳0.08g)稀释的一抗,4℃存放24-48h;吸去抗体,0.01MKPBS洗5min×3;
5.加入0.01MKPBS稀释的的二抗,室温孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3;
6.加入ABC复合物之类的抗体,室温孵育2h,0.01MKPBS洗5min×3;蒸馏水迅速冲三次;
7.加入显色液,进行免疫组织化学显色,时间一般不超过30min,可不时在显微镜下进行观察,待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液,用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应;
8.梯度酒精脱水之后,封片,拍照。