目的应用串联质谱技术通过检测干血滤纸片中的酰基肉碱谱，对遗传性代谢病高危儿童进行有机酸血症筛查和诊断研究。方法遗传性代谢病高危儿童1000例，男642例，女358例，年龄中位数为2岁(5天～15岁),手指采血，滴于滤纸片上。取直径为3mm的干血滤纸片放入96孔聚丙烯板，经含酰基肉碱内标的甲醇萃取，盐酸正丁醇衍生后，进行串联质谱分析。结果在1000例高危儿童中筛查并诊断有机酸血症40例(4.0%)，其中甲基丙二酸血症20例，丙酸血症6例，异戊酸血症3例，戊二酸血症I型3例，戊二酸血症II型3例，3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症1例，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症1例，生物素酶缺乏症2例，b-酮硫解酶缺乏症1例。患者临床表现主要为运动和智力发育落后、抽搐、意识障碍、肌张力低下、呕吐和喂养困难等。常规实验室检查主要表现为酸中毒、高血氨、高乳酸血症和低血糖等。结论串联质谱技术能够通过检测血滤纸片中的不同酰基肉碱浓度，对部分有机酸血症进行快速筛查和诊断，结合尿气相色谱/质谱技术，有助于提高有机酸血症诊断的准确性。上海新华医院小儿内科韩连书
【关键词】串联质谱；有机酸血症；酰基肉碱；遗传性代谢病
ApplicationofTandemMassSpectrometryindiagnosisoforganicacidemiasHANLian-shu,GAOXiao-lan,YEJun,QIUWen-jun,GUXue-fan.DepartmentofPediatricEndocrinology,GeneticandMetabolism,XinhuaHospital,ShanghaiSecondMedicalUniversity,ShanghaiInstituteforPediatricResearch,Shanghai200092,China
ObjectiveThediagnosisoforganicacidemiasisverydifficultandneedspecialtestmethods.Recentlythetandemmassspectrometryhadbeenusedinscreeninganddiagnosisoftheinbornerrorofmetabolism.Theaimofthepresentstudywastoutilizeadrybloodfilterpapermethodforacylcarnitinesprofilestestusingtandemmassspectrometryindiagnosisoforganicacidemiasinhighriskchildren.MethodOnethousandpatients(642weremalesand358females)withhighriskofinbornerrorofmetabolismwerestudied,Themedianoftheirageis2years.Thebloodwascollectedonfilterpaper,punchedandextractedintomethanolsolutionwithstableisotopelabeledinternalstandardsofacylcanitine,thenderivatizedwithbutanolic-HCI.Afterpreparation,thesampleswereanalyzedbytandemmassspectrometry.Thevolumeoftheacylcanitineswascalculatedbythespecialsoftware.ResultsFortypatients(4.0%)werediagnosedasorganicacidemiasamongthe1000patients,including20methylmalonicacidemia,6propionicacidemia,3isovalericacidemia，3glutaricacidemiatypeI,3glutaricacidemiatypeII,2biotinidasdeficiency,13-methylcrotonyl-CoAcarboxylasedeficiency，13-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAlyasedeficiency,and1beta-ketothiolasedeficiency.Thecommonclinicalsymptomsandsignsofthesepatientsweredevelopmentalandmentalretardation,spasm,lethargy,coma,hypotonia,vomiting,andfeedingdifficult.Routinelaboratorytestsweresuggestedbymetabolicacidosis,hyperammonemia,hyperlactonemia,hypoglycemia,anemialiverfunctionabnormal.ConclusionAnapartoforganicacidemiascanbefastdiagnosedbytandemmassspectrometrythroughacylcarnitineprofilesanalysisindrybloodfilterpaper.Thefastandaccuratediagnosisoforganicacidemiasbytandemmassspectrometrywillberisebycombinethegaschromatographymassspectrometry.
tandemmassspectrometry;organicacidemias;acylcarnitine;inbornerrorofmetabolism
有机酸血症主要是由于氨基酸、脂肪酸和糖代谢异常导致中间代谢产物－有机酸增加，而引起一系列病理生理改变和临床症状的一组疾病，由于患者尿中含有大量有机酸又称为有机酸尿症。我国以往由于检查条件的限制，有机酸血症诊断较困难，许多患者不能得到及早的诊断和治疗。气相色谱/质谱技术为有机酸尿症的诊断提供了条件。近几年发展的串联质谱新技术，通过快速检测血中酰基肉碱谱，为有机酸血症的筛查和诊断提供了新方法。我们在国内率先开展串联质谱新技术进行遗传性代谢病的筛查和诊断，现报告2003年1月～2004年10月1000例临床高危儿童有机酸血症筛查的结果和体会。
对象与方法
一、对象
临床疑似遗传性代谢病高危儿童1000例，分别来自上海、北京、广州、香港、澳门等全国20余个省、市、特区的55所医院，其中男642例，女358例，年龄中位数为2岁(5天～15岁)。健康儿童780例，来自托儿所和幼儿园，男489例，女291例，平均年龄7岁。通过检测健康儿童的血酰基肉碱水平确定本实验室的正常上限值。所有检测均取得家长的知情同意。
高危儿童临床表现包括反复呕吐、抽搐、昏迷或嗜睡、智力运动发育落后、生长发育迟缓、肌张力异常和肝脾肿大等，常规实验室检查提示有代谢性酸中毒、低血糖、高血氨、高乳酸血症等，均是原因不明者。标本采集用干血滤纸片法，手指采血或静脉抽血，滴于专用采血滤纸(S&S903#)上，晾干后送检。
二、试剂、材料和仪器
1.试剂：甲醇、盐酸正丁醇(3mol/L)、乙腈和氮气。盐酸正丁醇(3mol/L)由正丁醇和乙酰氯按9:1(v:v)配制。同位素内标：选用8种酰基肉碱的同位素内标对样品中20余种酰基肉碱进行定量，所有内标均购自美国剑桥同位素实验室，包括2H9-游离肉碱(2H9-carnitine,2H9-C0)，2H3-乙酰肉碱（2H3-acetylcarnitine，2H3-C2），2H3-丙酰肉碱（2H3-propionylcarnitine，2H3-C3），2H3-丁酰肉碱（2H3-butyrylcarnitine，2H3-C4），2H9-异戊酰肉碱（2H9-isovalerylcarnitine，2H9-C5），2H3-辛酰肉碱（2H3-octanoylcarnitine，2H3-C8），2H9-肉豆蔻酰肉碱（2H9-myristoylcarnitine，2H9-C14），2H3-棕榈酰肉碱（2H3-palmitoylcarnitine，2H3-C16）。上述同位素内标用甲醇稀释成工作液，4°C冰箱保存，1个月内用完。
2.材料：96孔聚丙烯板，96孔过滤板(滤膜孔径0.45mm)购自Millipore公司。
3.仪器：串联质谱仪(API2000型)购自美国生物应用系统公司(AppliedBiosysterms)，高效液相仪采用美国安捷仑公司(Agilent1100)产品。
三、测定方法
1．样品处理：参考报道的方法，取直径3mm的干滤纸血片(相当于3.2ml全血)，置于96孔过滤板中，每孔加入含酰基肉碱内标的甲醇溶液100ml，室温放置20min，萃取血片中的酰基肉碱，然后离心至另一个96孔聚丙烯板，50°C加热吹干，再加入60ml盐酸正丁醇(3mol/L)，Teflon膜覆盖，置65°C恒温箱内15min，随后50°C加热吹干，再加入80％乙腈100ml溶解，铝膜覆盖，即可上样检测。
2．仪器设置流动相采用80％乙腈，四元泵流速设置为30ml/min，自动进样器设置为每次进样20ml。酰基肉碱测定采用母离子扫描方式，子离子质荷比(m/z)为85，扫描范围为m/z210～m/z502，一个样品测试约需时间2.5min。
3．资料分析定量分析采用软件ChemoView1.2版本(美国应用生物系统公司)，根据各种丁酯化的同位素内标和酰基肉碱的离子峰强度，由已知浓度的内标，自动计算出所测样品中酰基肉碱的浓度。质控样品采用美国疾病控制和预防中心（CDC）新生儿筛查质控部门提供的串联质谱酰基肉碱血滤纸片。
四、有机酸血症的诊断
有机酸血症患者在有机酸代谢途经发生障碍时导致其中间代谢产物增加，包括不同种类的酰基肉碱增高。各型有机酸血症的诊断依据串联质谱特异性酰基肉碱谱的改变，结合尿气相色谱/质谱有机酸分析、临床表现和常规实验室检查等确定。
结果
一、筛查结果
在1000例高危儿童中确诊有机酸血症40例（4%），见表1。其中甲基丙二酸血症(MethylmalonicAcidemias，MMA)最多(50%)，其次为丙酸血症(PropionicAcidemia，PA，15%)、异戊酸血症((IsovalericAcidemia，IVA,7.5%)、戊二酸血症(GlutaricAcidemia，GA)I型和II型(各7.5%)、生物素酶缺乏症(5%)、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症(3-MethylCrotonyl-CoACarboxylaseDeficiency,3-MCC)、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoALyaseDeficiency,3-HMC)及b-酮硫解酶缺乏症各1例。表1列出了不同有机酸血症对应的串联质谱检测参数（不同种类的酰基肉碱），以及这些参数的正常儿童上限值和患儿的检测值。
表1高危儿童有机酸血症串联质谱筛查结果
疾病n异常标志浓度正常上限值
(％)(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)
甲基丙二酸血症20(50)C311.245.00
C3/C00.580.20
C3/C21.340.30
丙酸血症6(15)C339.845.00
C3/C01.200.20
C3/C22.230.30
异戊酸血症3(7.5)C52.530.40
戊二酸血症1型3(7.5)C5DC2.140.15
戊二酸血症2型3(7.5)多种酰基肉碱增高
3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症1(2.5)C5-OH2.420.60
3-羟-3-甲基戊烯二酰辅酶A裂解酶缺乏症1(2.5)C5-OH3.790.60
生物素酶缺乏症2(5.0)C38.755.00
C3/C00.180.20
C3/C20.310.30
C5-OH5.500.70
b-酮硫解酶缺乏症1(2.5)C5-OH2.310.70
C5:10.630.05
注：C3为丙酰肉碱，C5为异戊酰肉碱，C5DC为戊二酰肉碱，C5-OH为3-羟基异戊酰肉碱，C5:1为异戊烯酰肉碱
从表中可以看出患儿的检测值高于正常上限值数倍，甚至10余倍。MMA和PA患者均为丙酰肉碱(Propionylcarnitine，C3)增高，两者比较丙酸血症增高更显著(t=6.110,P