鱼磷酸化乙酰辅酶A羧化酶（pACCase）定量检测试剂盒（ELISA）
本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断。
【试剂盒名称】
鱼磷酸化乙酰辅酶A羧化酶（pACCase）定量检测试剂盒（ELISA）
【试剂盒用途】
定量检测鱼血清、血浆、组织液及其它相关液体样本中磷酸化乙酰辅酶A羧
（pACCase）的含量。
【检测原理】
本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）。将标准品、待测样
先包被鱼磷酸化乙酰辅酶A羧化酶（pACCase）单克隆抗体透明酶标包被板中，
间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去
分。依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为
在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中鱼磷酸化乙酰辅酶A羧化酶（pAC
呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中
酰辅酶A羧化酶（pACCase）含量。
【试剂盒组成】
1酶标包被板12孔×8条7显色剂A液6mL
2标准品0.3mL×6管8显色剂B液6mL
320倍浓缩洗涤液25mL9终止液6mL
4样本稀释液6mL10说明书1份
5特殊稀释液6mL11封板膜2张
6酶标试剂6mL12密封袋1个
备注：标准品（1号→6号）浓度依次为：400、200、100、50、25、12.5pg/mL.
【需要而未提供的试剂和器材】
1、37℃恒温箱
2、标准规格酶标仪
3、精密移液器及一次性吸头
4、蒸馏水
5、一次性试管
6、吸水纸
【操作步骤】
1、准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。
2、配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
3、加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、
待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先
加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL（即样本稀释5倍）；空白对照孔不加。
4、温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
5、洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸
上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。
6、加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。
7、温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
8、洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸
上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。
9、显色：每孔先加入显色剂A液50μL，再加入显色剂B液50μL，平板混匀器混匀30s
（或用手轻轻震荡混匀30s），37℃避光显色15min。
10、终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应（颜色由蓝色立转黄色）。
11、测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值（OD值）。
12、计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样
本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。最终浓
度为实际测定浓度乘以稀释倍数。
【样本要求】
1、样本不能含叠氮钠（NaN3），因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。
2、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能立即
试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
3、样本应充分离心，不得有溶血及颗粒。
【注意事项】
1、实验严格按照说明书的操作进行，实验结果判定必须以酶标仪读数为准。
2、酶标包被板开封后如未用完，应立即装入密封袋中加干燥剂保存。
3、建议所有的标准品、样本和空白对照都做双份检测，取平均值，以减小实验误差。
4、牢记样本已经稀释5倍，计算结果乘以5才是样本实际浓度。
5、本试剂盒定量范围为12.5-400pg/mL，超过此范围，为标准曲线延伸计算所得，不做为
准确定量结果，请用特殊稀释液稀释后测定准确结果（12.5-400pg/mL范围内），乘以总稀释
倍数即为样本最终浓度。
6、若显色过浅，可适当延长底物温育时间。
7、为避免交叉污染，标准品、样本和空白对照每加一个就要更换一次吸头；酶标工作液、
样本稀释液和底物等公共组分，要悬臂加样，不得碰到微孔；不得重复使用封板膜。
8、试剂盒保质期内使用，不同批号的试剂不得混用。
9、底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下
【操作程序总结】
准备试剂，样品和标准品
加入准备好的样品和标准品，37℃反应30分钟
洗板4次，加入酶标试剂，37℃反应30分钟
洗板4次，加入显色液A、B，37℃显色15分
加入终止液
15分钟之内读OD值
计算
【检测范围】
12.5pg/mL-400pg/mL
【规格】
96T/盒
【贮藏】
2-8℃，避光防潮保存。
【有效期】
6个月