一,基本原理
利用紫外-可见吸收光谱来进行定量分析由来已久，可追溯到古代，公元60年古希腊已经知道利用五味子浸液来估计醋中铁的含量，这一古老的方法由于最初是运用人眼来进行检测，所以又称比色法。到了16、17世纪，相关分析理论开始蓬勃发展，1852年，比尔(Beer)参考了布给尔(Bouguer)1729年和朗伯(Lambert)在1760年所发表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液层厚度相等时，颜色的强度与呈色溶液的浓度成比例，从而奠定了分光光度法的理论基础，这就是著名的朗伯-比尔定律。
1.紫外-可见吸收光谱的形成
吸光光度法也称做分光光度法，但是分光光度法的概念有些含糊，分光光度是指仪器的功能，即仪器进行分光并用光度法测定，这类仪器包括了分光光度计与原子吸收光谱仪(AAS)。吸光光度法的本质是光的吸收，因此称吸光光度法比较合理，当然，称分子吸光光度法是最确切的。
紫外-可见吸收光谱是物质中分子吸收200-800nm光谱区内的光而产生的。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级跃迁(原子或分子中的电子，总是处在某一种运动状态之中。每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。这些电子由于各种原因(如受光、热、电的激发)而从一个能级转到另一个能级，称为跃迁。)当这些电子吸收了外来辐射的能量就从一个能量较低的能级跃迁到一个能量较高的能级。因此，每一跃迁都对应着吸收一定的能量辐射。具有不同分子结构的各种物质，有对电磁辐射显示选择吸收的特性。吸光光度法就是基于这种物质对电磁辐射的选择性吸收的特性而建立起来的，它属于分子吸收光谱。跃迁所吸收的能量符合波尔条件：
二,应用范围
紫外-可见分光光度计可用于物质的定量分析、结构分析和定量分析。而且还能测定某些化合物的物理化学参数，如摩尔质量、配合物的配合比例和稳定常熟、酸碱电离常数等。
1.定性分析
紧外-可见分光光度法对无机元素的定性分析应用较少，无机元素的定性分析可用原子发射光谱法或化学分析的方法。在有机化合物的定性鉴定和结构分析中，由于紫外-可见光谱较简单，特征性不强，因此该法的应用也有一定的局限性。但是它适用于不饱和有机化合物。尤其是共轭体系的鉴定，以此推断未知物的骨架结构。此外，可配合红外光谱、核磁共振波谱法和质谱法进行定性鉴定和结构分析，因此它仍不失为是一种有用的辅助方法。
一般有两种定性分析方法，比较吸收光谱曲线和用经验规则计算最大吸收波长λmax，然后与实测值进行比较。
2.结构分析
结构分析可用来确定化合物的构型和构象。如辨别顺反异构体和互变异构体。
3.定量分析
紫外-可见分光光度定量分析的依据是Lambert-Beer定律，即在一定波长处被测定物质的吸光度与它的溶度呈线性关系。应此，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度可求出该物质在溶液中的浓度和含量。种常用的测定方法有：单组分定量法、多组分定量法、双波长法、示差分光光度法和导数光谱法等。
5.酸碱离解常数的测定
光度法是测定分析化学中应用的指示剂或显色剂离解常数的常用方法，该法特别适用于溶解度较小的弱酸或弱碱。
4.配合物组成及其稳定常数的测定
测量配合物组成的常用方法有两种：摩尔比法(又称饱和法)和等摩尔连续变化法(又称Job法)。
三,仪器结构
1.紫外-可见分光光度计的主要部件
全世界的紫外-可见分光光度计生产厂家有上百家，产品型号成千上万，但就基本结构来说，都是由五个部分组成，即光源、单色器(单色仪)、吸收池、检测器和信号指示系统。如下图所示：
光源
对光源的基本要求是：应在仪器操作所需的光谱区域内能够发射连续辐射;有足够的辐射强度和良好的稳定性，而且辐射能量随波长的变化应尽可能小。紫外-可见分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。热辐射光源用于可见光区。如钨丝灯和卤钨灯;气体放电光掉用于紫外光区，如氢灯和氘灯。
钨灯和碘钨灯可使用的范围在340～2500nm，这类光源的辐射能量与施加的外加电压有关，在可见光区，辐射的能量与工作电压的4次方成正比。光电流也与灯丝电压的n次方(n>l)成正比。因此必须严格控制灯丝电压，仪器必须备有稳压装置。
在近紫外区测定时常用氢灯和氘灯，它们可在160～375nm范围内产生连续光源。氘灯的灯管内充有氢的同位素氘，它是紫外光区应用最广泛的一种光源，其光谱分布与氢灯类似，但光强度比相同功率的氢灯要大3～5倍。
吸收池
吸收池用于盛放分析试样，一般有石英和玻璃材料两种。石英池适用于可见光区及紫外光区，玻璃吸收池只能用于可见光区。为减少光的反射损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向.在高精度的分析测定中(紫外区尤其重要),吸收池要挑选配对。因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。
单色器
单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色光的光学装置，其主要功能应该是能够产生光谱纯度高且波长在紫外可见区域内任意可调的单色光。单色器一般由入射狭缝、准直镜(透镜或凹面反射镜使入射光成平行光)、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。其核心部分是色教元件，起分光的作用。单色器的性能直接影响人射光的单色性，从而也影响到测定的灵敏度、选择性及校准曲线的线性关系等。
能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅。棱镜常用的材料有玻璃和石英两种。它们的色散原理是依据不同波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于350～3200nm的波长范围，即只能用于可见光区域内。石英棱镜适用的波长范围较宽，可从185～4000nm，即可用于紫外、可见、近红外三个光域。
光栅是利用光的衍射与干涉原理制成的。它可用于紫外、可见及近红外光域，而且在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点是各级光谱会重叠而产生干扰。
入射、出射狭缝，透镜及准直镜等光学元件中狭缝在决定单色器性能上起重要作用。狭缝的大小直接影响单色光纯度，但过小的狭缝又会减弱光强。
检测器
检测器的功能是检测光信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置，常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。它们通过光电效应将照射到检测器上的光信号转变成电信号。对检测器的要求是：在测定的光谱范围内具有高的灵敏度;对辐射能量的响应时间短，线性关系好;对不同彼长的辐射响应均相同，且可靠;噪音低，稳定性好等。
硒光电池对光的敏感范围为300～800nm，其中又以500～600nm最为灵敏。这种光电池的特点是能产生可直接推动微安表或检流计的光电流，但由于容易出现疲劳效应而只能用于低档的分光光度计中。
光电管在紫外-可见分光光度计上应用较为广泛。它的结构是以一弯成半圆柱形的金属片为阴极，阴极的内表面涂有光敏层，在圆柱形的中心置一金属丝为阳极.接受阴极释放出的电子。两电极密封于玻璃或石英管内并抽成真空。阴极上光敏材料不同，光谱的灵敏区也不同。可分为蓝敏和红敏两种光电管，前者是在镍阴极表面上沉积锑和艳，可用于波长范困为210～625nm;后者是在阴极表面上沉积了银和氧化艳。可用范围为625～1000nm。与光电池比较，它有灵敏度高、光敏范围宽、不易疲劳等优点。
光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比一般的光电管要高200倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。
信号指示系统
它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。早期常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动纪录装置等。现在很多型号的分光光度计都可配套计算机使用，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处埋。
2.紫外-可见分光光度计的分类
紫外-可见分光光度计的类型很多，但可归纳为三种类型：单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计。
单光束分光光度计
其光路示意图如前图(紫外-可见分光光度计的基本结构图)所示，经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶掖，以进行吸光度的测定。这种类型的分光光度计结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。国产722型，751型、724型、英国SP500型以及BackmanDU-8型等均属于此类光度计。
双波长分光光度计
其基本光路如下图所示。由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长的单色光;再利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池，然后经过光电倍增管和电子控制系统，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值ΔA(ΔA=A1-A2)。
双波长分光光度计的优点：对于多组分混合物、混浊试样(如生物组织液)的分析，以及存在背景于扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。通过光学系统转换，使双波长分光光度计能很方便地转化为单波长工作方式。如果能在两波长处分别记录吸光度随时间变化的曲线，还能进行化学反应动力学研究。
双光束分光光度计
其光路示意如下图所示，经单色器分光后经反射镜(M1)分解为弧度相等的两束光，一束通过参比池，另一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比池和样品他，还能自动消除光源强度变化所引起的误差。这类仪器有国产710型、730型和740型，日立220系列，岛津-210，英国UNICAMSP-700等等。
四,市面上的几种紫外仪器
1,岛津UV-2450/2550
主要技术指标
UV-2450/2550岛津紫外分光光度计技术指标项目：
内容设置波长范围：190～1100nm
测试波长范围：190～900nm(使用特殊检测器时，可达1100nm)
波长确定性：±0.3nm内装有自动波长校正功能
波长重复精度：±0.1nm
扫描速度
波长移动时：约3200nm/min;
波长扫描时：约900～160nm/min;
监控扫描时：约2500nm/min
波长设置：扫描开始波长和扫描结束波长能够以1nm单位设置，其它为0.1nm单位光源切换波长和波长同步自动切换，切换波长可在282～393nm范围任意设定(0.1nm单位)谱带宽度0.1/0.2/0.5/1/2/5nm6段转换响应对应于谱带宽度自动设置最佳的响应速度，最小值为0.1秒分辨率0.1nm杂散光UV-24500.015%以下(220nm，Nal10g/L溶液)0.015%以下(340nm，UV-39滤光片)UV-25500.0003%以下(220nm，Nal10g/L溶液)0.0003%以下(340nm，UV-39滤光片)
测光方式双光束方式(负反馈直接比例方式)
测光类型吸光度(Abs)，透射率(%)，反射率(%)，能量(E)吸光度-4～5Abs，透射率、反射率：0.0-999.9%
测光范围吸光度-9.999～9.999Abs
记录范围透射率、反射率：-999.9～999.9%
测光准确度±0.002Abs(0～0.5Abs);±0.004Abs(0.5～1.0Abs)±0.3%T(0～100%T)
以上由NIST930D标准滤光镜测试。重复测量精度±0.001Abs(0～0.5Abs)±0.002Abs(0.5～1.0Abs)，±0.1%T基线平坦度±0.001Abs以内(除去干扰，狭缝2nm，波长扫描速度低时)
基线校正计算机自动校正(电源启动时，自动存储备份的基线，可以再校正)漂移0.0004Abs/h(电源启动2小时后)
使用温度、湿度15～35℃，45～80%(不结露，30℃以上为70%以下)光源50W卤素灯(长寿命2000H型);
灯(插座型)，内装光源位置自动调整机构
分光器
UV-2450：单单色器，使用高性能闪耀全息光栅，象差校正型却尔尼特尔纳装置。
UV-2550衍射光栅：衍射光栅型双单色色器;前级单色器：双波长闪耀全息光栅。
主单色器：高性能闪耀全息光栏，象差校正型却尔尼特尔纳装置。
检测器光电子倍增管，R-928样品室
室内尺寸：宽150×长260×深120mm.
光束间距离：100mm，能够使用最大池程：100mm
电源内装AC100，120，220，240V切换器。50/60Hz共用250VA尺寸
尺寸：宽570×深660×高275mm
重量约36kg检测器变换为近红外灵敏度型光电倍增管时，不能满足上述主机标准的光学指标。(不含计算机、打印机)
2安捷伦PH8453
Agilent8453分光光度计作为适用于日常用户和临时用户的强大而高效的系统的核心部件，易于使用，且能方便地无缝集成到现代化实验室中。该分光光度计具有二极管阵列的所有优点：快速的扫描、极佳的灵敏度、近乎完美的波长重现性、优越的耐用性和可靠性、极少的保养工作，以及开放的样品区和显著改进的光学性能。其分辨率小于2纳米，波长范围为190-1100纳米，并且标准杂散光强度低于0.03%。
易于使用-内置的按钮可测定样品、标样和空白样，小巧的实验室工作台节省了占用空间，预校准的氘灯和钨灯光源更换方便，并且可以使用个人电脑磁盘对固件进行升级。
灵活的附件-内置接口可与各种附件互相连接，如安捷伦公司的多样品池传送器、Peltier恒温样品池架、吸液系统或自动进样系统，以及Gilson自动进样器、Labsphere漫反射组件，或CustomSensors&Technology公司的光纤耦合器。开放的样品区更便于拿取和更换样品。
稳定的光学系统-热稳定的陶瓷光谱仪的狭缝宽度为1纳米，波长范围为190-1100纳米。陶瓷机壳由CarlZeiss公司特许制造。
内置GLP-序列号和固件版本号内置于固件当中。自检程序将仔细检查灯光强度、波长准确度和噪音，以确保各次校验的一致性。内置的日志会给出自检结果以及有关仪器保养方面的注意事项。