如何确定光谱信号就是所标记探针的信号
荧光成像已经被用到基因、细胞和活体的研究中来，而在活体情况下所面临的挑战最多。
1.自发荧光的可变性。a在不同激发光条件下，自发荧光会有明显不同;b动物身体的不同部位会有不同的自发荧光;c同一只动物在不同时间自发荧光的波谱和强度也可以不同;d不同小鼠的自发荧光在波谱和强度上也有差别;e有时会受到饲料的影响。
2.所用探针的发射波长较长。用于基因和细胞水平荧光探针或荧光蛋白发射波长通常在600nm以下，而活体研究最佳的发射波长范围在600-900nm之间。
3.受探针浓度的影响。荧光探针通常通过尾静脉打入体内，探针会被动物的血液和组织稀释，如果没有明显的靶向，在活体内信号会比较弱，因此探针的靶向性一定要明确，如果没有靶向性，在活体条件下寻找探针的特征光谱会非常难。
4.受位置的影响。如果探针靶向的部位距体表较远，一方面激发光的射入会减少，同时发射光也会被组织吸收，位置越深，减少越多。因此如果靶向的部位较深，一定要保证探针的浓度使发光足够强，同时尽量选用发射波长较长的探针。
5.合成的探针在活体条件下容易发生变化。用化学或生物的方法合成探针通常在较纯的溶剂中发生反应，但是活体条件下，动物的血液、组织液成分复杂，亲水或疏水性质难以预测，网状内皮系统大量存在，在体外表现很好的探针也有可能在体内发生复杂的变化，导致探针发生结构改变或脱落，从而发射波谱也会发生未知的改变。
活体荧光成像面临着多方面的挑战，如何才能做到准确无误的寻找到所要的波谱，进而进行合适的光谱分离呢?以下是一些做体内荧光成像的一些建议：
1.探针体外表现稳定可靠。探针合成之后必须要在打入体内之前进行成像，确定发射波谱和强度，需要考察不同批次探针之间是否存在差异，是否有淬灭现象，如果可能的话，用血液等生物体液溶解探针观察是否存在变化。另外在体外观察探针时，也一定要用溶剂做对照。
2.要确定靶向性。也就是说要有阳性对照，比如说要做肿瘤的早期诊断，尽量参考前人研究先用确定能够靶向的分子作为阳性对照，这样打入体内后，确定能够在肿瘤位置找到探针的波谱，如此确定之后，找到适合体内光谱分离的拆分条件，用于之后的进一步实验。
3.活体成像时一定要有对照。也就是说有阴性对照组，比如通过阳性对照组确定波谱之后，以此光谱分离的拆分条件对阴性对照组进行拆分，如果条件合适的话，阴性对照组应该是没有相应信号的。如此，再比较拆分条件中探针的发射波长和体外观察时的发射波长，如果两者比较接近，那么就能够肯定所寻找的探针波谱就是所考察的信号。