微生物的代谢---ATP荧光检测技术教学目的和要求：通过本章的学习使学生掌握微生物的合成代谢和分解代谢的方式及发酵、呼吸等的概念。重点和难点：重点是微生物合成代谢和分解代谢的方式及发酵和呼吸的概念；难点是微生物代谢的方式和途径。教学方法：教师主讲教学效果追记：代谢作用是微生物的基本特征之一，由于代谢作用的正常进行，保证了微生物的生长与繁殖，如果代谢作用一旦停止，则生命活动也就停止，因此，代谢作用与生命的存在及发展密切相关。新陈代谢（Metabolis）简称代谢，指发生在活细胞中的各种分解代谢和合成代谢的总和。即：新陈代谢=分解代谢+合成代谢合成代谢(anabolism)是指生物体从体内（分解代谢的中间产物）或体外环境中取得原料，合成生物体的结构物质或具有各种生理功能的物质，也就是从简单的小分子合成复杂的大分子，以至合成细胞的结构成分，此过程需要提供代谢能。分解代谢(catabolism)是生物体内所有的分解作用，指各种营养物质或细胞结构物质降解成简单产物。此过程大多伴随能量释放。合成代谢与分解代谢在生物体中是耦联进行的，它们之间既有明显差别，又紧密相关。分解代谢为合成代谢提供能量和物质，而合成代谢又是分解代谢的基础。复杂分子简单分子+ATP+第一节微生物的能量代谢大家都知道，生物的一切活动都是耗能的，因此，能量代谢就成了新陈代谢中的核心，能量代谢的中心任务是把外界环境中多种形式的最初能源转换成生物的通用能源ATP。对微生物来讲，它们可利用的最初能源不外乎三种，即有机物、日光、及还原态无机物。因此研究能量代谢的机制实际上是追踪这三类能源如何一步步转化并释放出ATP。一、异养微生物的生物氧化和产能生物氧化就是发生在活细胞内的一系列产能氧化反应的总称。生物氧化与非生物氧化即燃烧有着若干相同点和不同点。相同点都是有机物氧化释放了其中的化学潜能，不同点是：（关于生物氧化和燃烧大家都熟悉，可提问大家）步骤：一步式快速反应多步式梯级反应条件：激烈温和产能方式：热光大部分为ATP能量利用率：低高生物氧化的形式包括：与氧结合；脱氢；失电子三种。过程：脱氢（或电子）；递氢（或电子）和受氢（或电子）结果：产能（ATP）；产还原力（H）和产小分子中间代谢物。（一）底物脱氢：主要有四条途径：EMP、HMP、ED途径和三羧酸循环（1）EMP途径（Embdem-Meyerhof-PatnasPathway）：EMP途径又称糖酵解途径或已糖二磷酸途径，它是经10步反应而产生2分子丙酮酸和2分子ATP的过程，可概括如下：2NADH+H+在有氧条件下，可再经呼吸链的氧化磷酸化反应产生……ATP；无氧条件下，则可还原丙酮酸产生乳酸或还原丙酮酸的脱羧产物----乙醛而产生乙醇。EMP途径的总反应式为：EMP途径是绝大多数生物所共有的基本代谢途径，下面详细介绍一下其10步反应。①葡萄糖形成葡萄糖-6磷酸：不同菌种通过不同方式实现这一步，在真菌中（好氧菌）通过需要Mg2+和ATP参与的已糖激酶来实现（在细胞内进行，不可逆）；大肠杆菌，链球菌，可借磷酸烯醇式丙酮酸—磷酸转移酶系统完成，在葡萄糖进入细胞之前就完成了。②6—磷酸--葡萄糖在磷酸异构酶作用下生成6-磷酸果糖。③6-磷酸-果糖通过磷酸果糖激酶催化成1，6-二磷酸果糖，该E是EMP途径的一个关键E，它的存在意识着该种微生物具有EMP代谢途径。果糖-1，6-二磷酸在果糖二磷酸醛缩E的催化下分裂成磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛。④
磷酸二羟丙酮在丙糖磷酸异构E的作用下，转化成3-磷酸甘油醛，只有这样才能继续进行下去。⑤
3-磷酸甘油醛在3-磷酸脱氢E的催化下产生1，3-二磷酸甘油酸。它能将无机磷酸结合到反应产物上连衣裙一氧化反应由于产生一个高能磷酸化合物和NADH+H+，所以从产能和产还原力的角度来看都是十分重要的。⑥
1，3-二磷酸甘油酸在磷酸甘油激E的催化下形成3-磷酸甘油酸。此E是一种依赖Mg2+的E，它催化1，3-二磷酸甘油酸1C位上的高能磷酸基转移到ADP分子上，产生了本途径中的第一个ATP。⑦
3—磷酸甘油酸在磷酸变位E的作用下转变成2-磷酸甘油酸。⑧
2-磷酸甘油酸在烯醇E作用下，经脱水反应而产生含有一个高能磷酸键的磷酸烯醇式丙酮酸。烯醇E需要Mg2+、Mn2+或Zn2+等二价离子作激活剂。⑨
磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激E的催化下产生了丙酮酸，这时，磷酸烯醇式丙酮酸分子上的磷酸基团转移到ADP上产生了本途径的第二个ATP，这是借底物水平磷酸化而产生ATP的又一个例子。由以上途径可知，在无氧条件下整个EMP途径的产能效率是很低的，每个葡萄糖分解产生2个ATP，但其中产生的多种中间代谢物不仅可为合成反应提供原材料，而且起着连接许多有关代谢途径的作用。从微生物发酵生产的角度来看，EMP途径与乙醇、乳酸、甘油、丙酮、丁醇和丁二醇等大量重要发酵产物的生产有密切关系。（所以EMP途径为M生理活动提供ATP和NADH；其中间产物可为M的合成代谢提供碳架）（2）HMP途径：（HexoseMonophosPhatpPatgway）：即已糖磷酸途径，又称戊糖磷酸途径，Warburg—Dickens途径，或磷酸葡萄糖酸途径。该途径是一条葡萄糖不经EMP和TCA途径而得到彻底氧化，并产生大量的能量。其概况如下：P5-9一般认为HMP途径不是产能途径，而是为生物合成提供大量还原力（NADPH）和中间代谢产物。具体步骤可参阅（周P129、130）及生化。HMP途径在微生物的生命活动中有重要意义：（1）为核苷酸和核酸的生物合成提供戊糖—磷酸（核酮糖-5-磷酸是合成核酸、某些辅酶和组氨酸的原料）（2）产生大量的NADPH2还原剂，它不仅为合成脂肪酸、固醇等重要细胞物质所需要，而且可以通过呼吸链产生大量能量，（但这不是代谢中的主要方式，不能把HMP途径看作是产生ATP的有效途径）这些都是EMP和TCA过程无法完成的，因此凡存在HMP途径的微生物，当它们处在有氧条件下时就不必再依赖TCA循环获得所需的NADH2。（3）如果微生物对戊糖的需要超过HMP途径的正常供应量时，可通过EMP途径与本途径在1，6-二磷酸果糖和3-磷酸甘油醛处的连接来加以调剂。（4）反应中的赤藓糖可用于合成芳香氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸。（5）由于在反应中存在着C3—C7的各种糖，使具有HMP途径的微生物的碳源利用范围更广，如它们可以利用糖作碳源。（6）通过本途径而产生的重要发酵产物很多，如核苷酸，各种氨基酸、辅酶和乳酸等。（3）ED途径（Enter-DoudoroffPathway）又称2-酮脱氧-6磷酸葡萄糖酸裂解途径。（KDPG）ED途径是在研究嗜糖假单胞菌时发现的，是少数缺乏完整EMP途径的微生物所具有的一种替代途径，如在革兰氏阴性菌中分布较广，特别是假单胞菌和固氮菌的某些菌株较多存在，在其它生物中还未发现。其特点是葡萄糖只经4步反应即可获得EMP途径须经10步才能获得的丙酮酸。其总反应可概括为：注：6-PG脱水酶为6-磷酸葡萄糖脱水酶。ED途径是少数EMP途径不完整的细菌所特有的利用葡萄糖的替代途径，其特点是：反应步骤简单，产能效率低1分子葡萄糖仅产1分子ATP，是EMP途径的一半）由于ED途径可与EMP、HMP途径以及TCA循环相连接，因此可以相互协调，以满足微生物对能量，还原力和不同中间代谢物的需要。，进入三羧酸循环。（4）三羧酸循环（TricarboxylicAcidCycly）又称TCA循环，Krebs循环或柠檬酸循环。该循环在绝大多数异养微生物的氧化性（呼吸）代谢中起着关键性的作用。从微生物的物质代谢中可以看出TCA循环是处于枢纽的地位，工业中生产的柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸和谷氨酸等，都可在这个循环中看到。（二）递氢和受氢：在生物体中，贮存在葡萄糖等有机物中的化学能，经上述的多种途径脱氢后，经呼吸链（或称电子传递链）等方式进行递氢，最终与受氢体CO2、无机物结合，以释放其化学潜能，根据递氢特别是受氢过程中氢受体性质不，可把生物氧化区分成呼吸（有氧呼吸）、无氧呼吸和发酵三种类型。1、呼吸（Respiration）呼吸是一种最普遍和最重要的生物氧化方式，其特点是底物按常规方式脱氢后，经完整的呼吸链（RC，RespiratoryChain，又称电子传递链）递氢，最终由分子氧接受氢并产生水和释放能量（ATP）由于呼吸是在有氧条件下进行，故又称有氧呼吸。呼吸链是指位于原核细胞膜上或真核细胞线粒体膜上的，由一系列氧化还原势不同的氢传递体（或电子传递体）组成的一组链状传递顺序，它能把H或电子从低氧化还原势的化合物传递给高氧化还原势的分子氧或其它无机、有机氧化物，并使它们还原。在H或电子传递过程中，通过与氧化磷酸化反应发生偶联，就可产生ATP形式的能量。组成呼吸链的H或电子的载体，除醌类外，都是一些含有辅基的酶。正是依靠这些辅E或辅基才能实现它们在呼吸链中所执行的氧化还原功能。每种辅E或辅基在氧化与还原条件下，都有一定的吸光值，故用分光光度计可确定呼吸链的组分及其所处状态。在微生物中，最重要的呼吸链组分有以下几种：（1）烟酰胺嘌呤二核苷酸（NAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）：某些脱氢E含有NAD+或NADP+形式的辅酶，能从还原性底物上移出1个H+和2个电子，而变成还原态的NADPH+H+（2）黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黄素单核苷酸（FMN）FAD和FMN是一类称为黄素蛋白（FP）的脱氢酶的辅基。它们的活性基团是异咯嗪结构，其递H功能和基本结构如下：（3）铁硫蛋白（Fe-S）：铁硫蛋白存在于呼吸链的几种酶复合体中，参与膜上的电子传递。（4）泛醌（辅酶Q）：是一类脂溶性的氢载体，泛醌广泛存在于真核生物线粒体内膜和G-菌的细胞膜上。它在呼吸链中的功能是传递H，传递过程分两步进行，中间体是半醌。在呼吸链中，醌的含量比其它组分多10-15倍，其作用是收集来自呼吸链各种辅酶和辅基所输出的H，然后再将它们传递给细胞色素系统。（5）细胞色素系统：细胞色素系统位于呼吸链的后端，它们的功能是传递电子而不是传递氢。它们只从泛醌中接受电子，同时将同等数目的质子推到线粒体或细胞膜（原核生物）外的溶液中。细胞色素按其吸收光谱和氧还电位的差别可分成多种类型。如CytA、A3、B、C、和O等。不论在真核生物或原核生物中，呼吸链的主要组分都是类似的，一般为：NAD（P）---FP----FeS----COQ----CytB----CytC----CytA----CytA3；呼吸链在传递H或电子的过程中，通过与氧化磷酸化作用偶联，产生了生物通用能源ATP，其机制目前仍在研究中。2、无氧呼吸（AnaerobicRespirAtion）无氧呼吸又称厌氧呼吸，是一类呼吸链末端的氢受体为外源无机氧化物（个别为有机氧化物）的生物氧化。这是一类在无氧条件下进行的产能效率较低的特殊呼吸，其特点是底物按常规途径脱氢后，经部分呼吸链递氢，最终由氧化态的无机物（个别是有机物延胡索酸）受氢，得到还原。根据呼吸链末端的最终受体的不同，可把无氧呼吸分为以下类型：（二版P112）（1）硝酸盐呼吸（nitraterespiration）又称反硝化作用（denitrification）。硝酸盐在微生物生命活动中具有两种功能，其一是在有氧或无氧条件下所进行的利用硝酸盐作为氮源营养物，称为同化性硝酸盐还原作用（assindlativenitratereduction）；另一是在无氧条件下，某些兼性厌氧微生物利用硝酸盐作为呼吸链的最终氢受体，把它还原成亚硝酸、NO、N2O直至N2的过程，称为异化性硝酸盐还原作用（dissimilativenitratereductio），又称硝酸盐呼吸或反硝化作用。这两个还原过程的共同特点是硝酸盐都要通过一种含钼的硝酸盐还原酶将其还原为亚硝酸盐。能进行硝酸盐呼吸的都是一些兼性厌氧微生物——反硝化细菌，如地衣芽抱杆菌、脱氮副球菌、铜绿假单胞菌和脱氮硫杆菌等。在通气不良的土壤中，反硝化作用会造成氮肥的损失，其中间产物NO和N2O还会污染环境，故应设法防止。（2）硫酸盐呼吸（suifaerespiration）是一类称作硫酸盐还原细菌（或反硫化细菌）的严格厌氧菌在无氧条件下获取能量的方式，其特点是底物脱氢后，经呼吸链递氢，最终由末端氢受体硫酸盐受氢，在递氢过程中与氧化磷酸化作用相偶联而获得ATP。硫酸盐呼吸的最终还原产物是H2S。能进行硫酸盐呼吸的严格厌氧菌有脱硫脱硫弧菌，巨大脱硫弧菌和致黑脱硫肠状菌等。在浸水或通气不良的土壤中，厌氧微生物的硫酸盐呼吸及其有害产物对植物根系生长十分不利（例如引起水稻秧苗的烂根等），故应设法防止。（3）硫呼吸（sulphurrespiration）以无机硫作为呼吸链的最终氢受体并产生H2S的生物氧化作用。能进行硫呼吸的都是一些兼性或专性厌氧菌，例如氧化乙酸脱硫单胞菌。（4）铁呼吸（ironrespiration）在某些专性厌氧菌和兼性厌氧菌（包括化能异养细菌、化能自养细菌和某些真菌）中发现，其呼吸链末端的氢受体是Fe3+。（5）碳酸盐呼吸（carbonaterespiraion）是一类以CO2或重碳酸盐作为呼吸链末端氢受体的无氧呼吸。根据其还原产物不同而分两类：其一是产甲烷菌产生甲烷的碳酸盐呼吸，其二是产乙酸细菌产生乙酸的碳酸盐呼吸。它们都是一些专性厌氧菌。（6）延胡素酶呼吸（fumarterespiration）以往都把琥珀酸的形成看作是微生物所产生的一般中间代谢物，可是在延胡索酸呼吸中，琥珀酸却是末端氢受体延胡索酸的还原产物。能进行延胡索酸呼吸的微生物都是一些兼性厌氧菌，如埃希氏菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属和克氏杆菌属等肠杆菌；一些厌氧菌如拟杆菌属、丙酸杆菌属和产瑰用酸弧菌等也能进行延胡索酸呼吸。近年来，又发现了几种类似于延胡索酸呼吸的无氧呼吸，它们都以有机氧化物作无氧环境下呼吸链的末端氢受体，包括甘氨酸（还原成乙酸）、二甲基亚矾卜MSO，还原成二甲基硫化物（dimethylsulfide，DMS）］，以及氧化三甲基胶「trimethylamineoxide，还原成三甲基胺（trimethylamine）」等。3、发酵（Fermentation）：发酵一词被大家广泛应用。在发酵工业上，发酵是指任何利用（好氧或厌氧）微生物来生产有用代谢产物的一类生产方式；而在生物氧化或能量代谢中，发酵仅是指在无氧条件下，底物脱氢后所产生的还原力不经呼吸链传递而直接交给某一内源氧化性中间产物的一类低效产能反应。P5-20发酵的类型很多，以下介绍与EMP、HMP、ED途径有关的几类发酵和Stickland反应的氨基酸发酵加以阐述：（1）由EMP途径中丙酮酸出发的发酵：丙酮酸是EMP途径中的关键产物，从此出发，不同的微生物可进行不同的发酵：（二版P114）（2）通过HMP途径的发酵-----异型乳酸发酵凡葡萄糖发酵后只产生分子乳酸的发酵叫同型乳酸发酵。除产生乳酸外，还可产生乙醇，CO2等多种产物的发酵称异型乳酸发酵。一些异型发酵乳酸的微生物，因缺乏EMP途径中的一些重要E，如醛缩酶和异构E，因此其对葡萄糖的降解，完全依赖HMP途径。不同的微生物虽然都进行异型乳酸发酵，但其途径和产物是不相同的。如同型乳酸发酵通过EMP途径，产生2分子乳酸和2ATP；异型乳酸发酵通过HMP途径，有的产生1分子ATP（肠明串珠菌），有的产生2分子ATP，如短乳杆菌。（3）通过ED途径进行的发酵：通过ED途径的发酵就是指细菌的酒精发酵。酒精发酵有三个类型，即通过EMP途径的酵母酒精发酵、通过HMP途径（异型乳酸发酵）的细菌酒精发酵和通过ED途径的细菌酒精发酵。与乳酸发酵相类似，因为葡萄糖通过EMP与ED途径都可产生2个乙醇分子，我们也可称其为“同型酒精发酵”（homoalcholifermentation），而通过HMP途径的酒精发酵因1个葡萄糖分子会产生1分子乙醇和1分子乳酸，故我们也可称其为“异型酒精发酵”（heteroalcoholifermentation）。现将它们的反应式分别列在下面。①酵母的“同型酒精发酵”：由酿酒酵母等通过EMP途径进行。葡萄糖十2ADP＋2Pi——2乙醇十2CO2＋2ATP②细菌的“同型酒精发酵”：由运动发酵单胞菌等通过ED途径进行。葡萄糖十ADP＋Pi——2乙醇十2CO2＋ATP③细菌的“异型酒精发酵”：由Leuconostocmesenteroides等通过HMP途径进行。葡萄糖十ADP＋Pi——乳酸十乙醇十CO2＋ATP（4）氨基酸发酵产能——StiCkland反应1934年，L．HStiCklsnd发现少数厌氧梭菌例如Ibobospepe（生孢梭菌）能利用一些氨基酸同时当作碳源、氮源和能源，经深入研究后，发现其产能机制是通过部分氨基酸（如丙氨酸等）的氧化与另一些氨基酸（如甘氨酸等）的还原相偶联的发酵方式。这种以一种氨基酸为氢供体，以另一氨基酸为氢受体的产能发酵类型，称为StiCkland反应。它的产能效率很低，每分子氨基酸只能产1个ATP。第二节耗能代谢在上一节中，我们讨论了微生物如何将光能和化学能转变为生物能的过程。本节将阐明微生物利用这些能量合成细胞物质及其他耗能代谢的过程（如运输、运动、生物发光等生理过程）。一、细胞物质的合成微生物利用能量代谢所产生的能量、中间产物以及从外界吸收的小分子，合成复杂的细胞物质的过程称为合成代谢。合成代谢所需要的能量由ATP和质子动力提供。合成代谢和分解代谢的关系：1、合成代谢和分解代谢途径不同：糖类、氨基酸、脂肪酸、嘌吟、嘧啶等主要细胞成分的合成反应的生化途径中，合成代谢和分解代谢虽有共同的中间代谢物参加，但在生物合成途径中，一个分子的生物合成化学途径与它的分解代谢途径通常是不同的。其中可能有相同的步骤，但导向一个分子合成的途径与从该分子开始的降解途径间至少有一个酶促反应步骤是不同的。2、合成代谢和分解代谢相偶联，但方向是不可逆的：需能的生物合成途径与产能的ATP分解反应相偶联，因而生物合成方向是不可逆的。3、合成代谢和分解代谢的调节机制无关：调节生物合成的反应，与相应的分解代谢途径的调节机制无关，因为控制分解代谢途径速率的调节酶，并不参与生物合成途径。生物合成途径主要是被它们的末端产物的浓度所调节。1、CO2的固定CO2是自养微生物的唯一碳源，异养微生物也能利用CO2作为辅助的碳源。将空气中的CO2同化成细胞物质的过程，称为CO2的固定作用。微生物有两种同化CO2的方式，一类是自养式，另一类为异养式。在自养式中，CO2加在一个特殊的受体上，经过循环反应，使之合成糖并重新生成该受体。在异养式中，CO2被固定在某种有机酸上。因此异养微生物即使能同化CO2，最终却必须靠吸收有机碳化合物生存。自养微生物同化CO2所需要的能量来自光能或无机物氧化所得的化学能，固定CO2的途径主要有以下三条：（1）卡尔文循坏（CalvincyCle）这个途径存在于所有化能自养微生物和大部分光合细菌中。经卡尔文循环同化CO2的途径可划分为三个阶段，CO2的固定；CO2的还原；CO2受体的再生。卡尔文循环每循环一次，可将六分子CO2同化成一分子葡萄糖，其总反应式为：6CO2＋18ATP＋12NAD（P）H——C6H12O6＋18ADP＋12NAD（P）+＋18Pi（2）还原性三羧酸循环固定CO2这个途径是在光合细菌、绿硫细菌中发现的。第一步反应是将乙酰COA还原羧化为丙酮酸，后者在丙酮酸羧化酶的催化下生成磷酸烯醇式丙酮酸，随即被羧化为草酰乙酸，草酰乙酸经一系列反应转化为琥珀酸COA，再被还原羧化为a一酮戊二酸。a一酮戊二酸转化为柠檬酸后，裂解成乙酸和草酰乙酸。乙酸经乙酰一GOA合成酶催化生成乙酰COA，从而完成循环反应。每循环一次，可固定四分子CO2，合成一分子草酰乙酸，消耗三分子ATP、两分子NAD（P）H和一分子FADH2。乙酰COA——丙酮酸——磷酸烯醇式丙酮酸——草酰乙酸——琥珀酸COA——a一酮戊二酸——柠檬酸——乙酸+（草酰乙酸）——乙酰COA（3）还原的单羧酸环这个体系与还原羧酸环不同，不需要ATP，只要有Fd（red）就可运转。2．生物固氮所有的生命都需要氮，氮的最终来源是无机氮。尽管大气中氮气的比例占了79％，但所有的动植物以及大多数微生物都不能利用分子态氮作为氮源。目前仅发现一些特殊类群的原核生物能够将分子态氮还原为氨，然后再由氨转化为各种细胞物质。微生物将氮还原为氨的过程称为生物固氮（图5－ZI）。具有固氮作用的微生物近50个属，包括细菌、放线菌和蓝细菌。目前尚未发现真核微生物具有固氮作用。根据固氮微生物与高等植物以及其他生物的关系，可以把它们分为三大类：自生固氮体系、共生固氮体系和联合固氮体系。好氧自生固氮菌以固氮菌属（Azototxicter）较为重要，固氮能力较强。厌氧自生固氮菌以巴氏固氮梭菌（Charofiumposteurtanum）较为重要，但固氮能力较弱。共生固氮菌中最为人们所熟知的是根瘤菌（Rhihoium），它与其所共生的豆科植物有严格的种属特异性。此外，弗兰克氏菌（Frank勿）能与非豆科植物共生固氮。营联合固氮的固氮菌有雀稗固氮菌（A．加guh）、产脂固氮螺菌（AmpirillumIcbm）等，它们在某些作物的根系料质鞘内生长发育，并把所固定的氮供给植物，但并不形成类似根瘤的共生结构.微生物之所以能够在常温常压条件下固氮，关键是靠固氮酶的催化作用。固氮酶的结构比较复杂，由铁蛋白和钼铁蛋白两个组分组成。固氮作用是一个耗能反应，固氮反应必须在有固氮酶和ATP的参与下才能进行。每固定lmol氮大约需要21molATP，这些能量来自于氧化磷酸化或光合磷酸化。在体内进行固氮时，还需要一些特殊的电子传递体，其中主要的是铁氧还蛋白和含有FMN作为辅基的黄素氧还蛋白。铁氧还蛋白和黄素氧还蛋白的电子供体来自NADH，受体是固氮酶。固氮作用分为以下几个阶段：（补综合P330）1．固氮酶的形成还原型吡啶核苷酸的电子经载体铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白（Fld）传递到组分Ⅱ的铁原子上形成还原型组分Ⅱ，它先与ATP－Mg结合生成变构的ⅡMg－ATP复合物；然后再与此时已与分子氮结合的组分I一起形成1：1的复合物——固氮酶。2．固氮阶段固氮酶分子的一个电子从组分ⅡMg－ATP复合物转移到组分1的铁原子上，由此再转移给钼结合的活化分子氮。通过6次这样的电子转移，将1分子氮还原成2分子NH3。组分ⅡMg－ATP复合物转移掉电子以后恢复成其氧化型，同时ATP水解成为ADP＋Pi。H2的产生是固氮酶反应机理中一个不可分割的组成部分。固氮作用的产物NH3与相应的a一酮酸结合生成相应的氨基酸，然后进一步合成蛋白质或其他有关的化合物。3．固氮酶的调节在富氨的环境中或氨过量时，固氮酶合成受阻，这是一种在终产物过量时避免能量和养料浪费的方法。在一些固氮的光合细菌中，固氮酶的活力也受到氨的抑制，这种抑制作用称为氨“关闭”。效应。此时，过量的氨通过使固氮酶发生共价修饰而导致酶失活；当氨再次限量时，被共价修饰的酶又回复到其活性状态。（二）好氧固氮菌防止氧伤害其固氮酶的机理好氧菌解决需氧但又必须防止氧伤害其固氮酶的机理主要有：1．固氮菌属保护固氮酶的机理如呼吸保护：该属的许多细菌以较强的呼吸强度迅速耗去固氮部位周围的氧；构象保护：褐球固氮菌等有一种起着构象保护功能的蛋白质——FeS蛋白质Ⅱ，通过与固氮酶结合或解离而起到保护作用。2．蓝细菌保护固氮酶的机理分化有异形胞的丝状细菌在异形胞中进行固氮作用。异形胞是部分蓝细菌适应于在有氧条件下进行固氮作用的特殊细胞。没有异形胞的蓝细菌有的将固氮作用与光合作用分开进行，有的在失去光合系统11的细胞中进行固氮作用等。3．根瘤菌保护固氮酶的机理以类菌体形式生活在豆科植物根瘤中，类菌体周围有周膜包围，膜上有一种能与氧发生可逆性结合的蛋白——豆血红蛋白，它与氧的亲合力极强，起着调节根瘤中膜内氧浓度的功能。（三）肽聚糖的合成肽聚精不仅具有重要的结构与生理功能，还是青霉素、万古霉素、环丝氨酸（恶唑霉素）与杆菌肽等许多抗生素作用的靶物质。肽聚糖的生物合成过程复杂，步骤多，而且合成部位几经转移。为此把肽聚糖的生物合成分为细胞质中、细胞膜上以及细胞股外合成3个阶段。以金黄色葡萄球菌的肽聚糖合成为例说明：第一阶段，在细胞质中合成胞壁酸五肽；第二阶段，在细胞膜上由N一乙酸胞壁酸五肽与N一乙酸葡萄糖胶合成肽聚糖单体——双糖肽亚单位；第三阶段，已合成的双糖肽插在细胞膜外的细胞壁生长点中并交联形成肽聚糖的伸长，并通过转肽酶的转肽作用使相邻多糖链交联。转肽作用为青霉素所抑制。3．二碳化合物的同化三羧酸循环是产能反应和生物合成的重要代谢环节，其中的有机酸可被微生物利用，作为电子的供体和碳源。四碳、五碳、六碳酸均可在有氧环境下被微生物利用，通过氧化磷酸化产生能量。但三羧酸循环只有在受体分子草酰乙酸在每次循环后都能得到再生的情况下才能进行。若将三羧酸循环中的有机酸分子移去用于生物合成将会影响三核酸循环的进行。微生物可利用回补途径（renfenishmntPathway）来解决这一矛盾。所谓回补途径就是指能补充兼用代谢途径（如三羧酸循环）中因合成代谢而消耗的中间代谢产物的反应。不同的微生物以及在不同条件下具有不同的回补途径，主要有乙醛酸循环途径和甘油酸途径。（1）乙醛酸循环当乙酸被作为底物时，草酸乙酸将会通过乙醛酸途径再生。这条途径由三羧酸循环中的反应和另外的两种酶组成：异柠檬酸裂解酶（催化异柠檬酸裂解成流由酸和乙醛酸）和苹果酸含成酶（将乙醛酸和乙酸辅酶A转化为苹果酸）。乙醛酸循环的生物合成途径如图5－22所示。异柠檬酸被裂解成城由酸和乙醛酸，使流浪酸可以进人生物合成途径，因为乙醛酸可以和乙酷辅酶A结合生成苹果酸。苹果酸又可以被转化为草酸乙酸以维持三核酸循环的进行。琉璃酸可以直接用于叶琳的合成，或者氧化为草酷乙酸后作为四碳氨基酸的碳骨架，或者用于合成葡萄糖（经由草酸乙酸和磷酸烯醇式丙酮酸）。乙醛酸循环比较普遍地存在于好氧微生物中。细菌中的醋酸杆菌、固氮菌。大肠杆菌，以及真菌中的酵母菌、黑曲霉和青霉菌等，都已证明有乙醛酸循环，它们可以利用乙酸作为唯一碳源和能源生长。（2）甘油酸途径当微生物以甘氨酸、乙醇酸和草酸作为底物时，则通过甘油酸途径补充三羧酸循环中的中间产物。二碳化合物，如甘氨酸、乙醇酸等，都要先转化为乙醒酸，然后两分子的乙醛酸缩会成羟基丙酸半醛，随后在还原酶的作用下生成甘油酸。甘油酸经氧化后进入EMP途径，生成磷酸烯酸式丙酮酸和丙酮酸。它们可接受COZ，生成四碳二嫂酸，进入三坡酸循环。由乙醛酸生成甘油酸的途径，称为甘油酸途径（图5－23）。许多微生物都在这条途径，可以利用乙醇酸、草酸和甘氨酸等二碳化合物作为唯一碳源生长。4．糖类的合成微生物在生长过程中，除了有分解糖类的能量代谢外，不断地从简单化合物合成糖类，以构成细胞生长所需要的单糖、多糖等。单糖在微生物中很少以游离形式存在，一般以多糖或多聚体的形式，或是以少量的糖磷酸脂和糖核音酸形式存在。单糖和多糖的合成对自养和异养微生物的生命活动十分重要。（1）单糖的合成无论自养微生物还是异养微生物，其合成单糖的途径一般都是通过EMP途径逆行合成葡糖一6一磷酸，然后再转化为其他的糖。因此单糖合成的中心环节是葡萄糖的合成。但自养微生物和异养微生物合成葡萄糖的前体来源不同。自养微生物通过卡尔文循环可产生甘油醛一3一磷酸，通过还原的叛酸环可得到草醉乙酸或乙酸辅酶地异养微生物可利用乙酸为碳源经乙醛酸循环产生草酸乙酸；利用乙醇酸、草酸、甘氨酸为碳源时通过甘油酸途径生成甘油醒一3一磷酸；以乳酸为碳源时，可直接氧化成丙酮酸；将生糖氨基酸脱去氨基后也可作为合成葡萄糖的前体。生物合成反应中所需的己糖可从外界环境获得或用非糖前体物来合成。主要的合成途径见图5－24。已糖生物合成中的两个关键中间物是葡糖一6一磷酸和UDP一葡萄糖。葡糖一6一磷酸作为能量来源是葡萄糖氧化和糖酵解过程的重要中间产物，或者转化为O入或者转化为发酵产物，葡糖一6一磷酸也可逆向进入多糖合成途径。在这种情况下，它转化为UDP一葡萄糖（LJDPG）。UDPG＃有尿呼唤核青，故称为核音糠。UDPG是葡萄糖的活化形式，它既可作为其他核音糖合成时的起始物质，也可作为细胞多糖的葡萄糖前体。如果说在葡萄糖分解代谢中葡糖一6一磷酸是一个关键中间代谢物的话，UDPG则是葡萄糖合成代谢中的关键中间代谢物。当微生物含有可作为能源和碳源的巴糖时，这些已糖同时也可作为生物合成代谢的前体。但也有许多微生物可生长在无已糖的培养基上。在这种情况下，合成细胞壁及其他含己糖的多聚物所需的已糖必须由糖异生途径来合成。糖异生途径是由非碳化合物前体合成新的葡萄糖分子的过程。糖异生作用的起始物质是磷酸烯酸式丙酮酸（PEP），糖酵解过程中的一种重要的中间代谢物。PEP可在不同于糖酵解途径中的酶作用下，逆向合成葡糖一6一磷酸。糖异生过程中所需的PEP主要由草酸乙酸脱淡而得，而草酸乙酸是三核酸循环中的一个重要的中间产物。在大多数情况下，戊糖是将已糖脱去一个碳原子而得到的。这个反应可由多种途径实现。其中最普遍的是经由葡糖一6一磷酸的氧化脱漆途径，产生CQZ和一个五碳中间物，核酮糖一5一磷酸。核酮糖一5一磷酸可转化为另外两种戊糖，其中一种即是核糖一5一磷酸，可直接用于RNA的合成。核糖一5一磷酸可经酶还原反应生成脱氧核糖用于DNA合成。（2）多糖的合成微生物细胞内所含的多糖是一种多聚物，包括同多糠和杂多糖。同多糖是由相同单糖分子聚合而成的糖类，如糖原、纤维素等。杂多糖是由不同单糖分子聚合而成的糖类，如肽聚糖、脂多糖和透明脂酸等。多糖的合成不仅仅是分解反应的逆转，而是以一种核耷糖为起始物，接着糖单位逐个地添加在多糖链的末端。促进合成的能量是由核着糖中高能糖一磷酸键水解中得到。多糖的合成是靠转移酶类的特异性来决定亚单位在多聚链上的次序的，并且在合成的起始阶段需要一个引子作为添加单位的受体，另外还需要糖核音酸作为糖基载体，将单糖分子转移到受体分子上，使多糖链逐步加长。5．氨基酸的合成在蛋白质中通常存在着21种氨基酸。对于那些不能从环境中获得部分或全部现成氨基酸的生物，就必须从另外的来源去合成它们。在氨基酸合成中，主要包含着两个方面的问题：各氨基酸碳骨架的合成以及氨基的结合。合成氨基酸的碳骨架来自糖代谢产生的中间产物，而氨有以下几种来源：一是直接从外界环境获得；二是通过体内含氧化合物的分解得到；三是通过固氮作用合成;·四是由硝酸还原作用合成。另外，在合成含硫氨基酸时，还需要硫的供给。大多数微生物可从环境中吸收硫酸盐作为硫的供体，但由于硫酸盐中的硫是高度氧化状态的，而存在于氨基酸中的硫是还原状态的，所以无机硫要经过一系列的还原反应才能用于含硫氨基酸的合成。氨基酸的合成主要有三种方式：一是氨基化作用，二是通过转氨基作用，三是由糖代谢的中间产物为前体合成氨基酸。在由前体转化为氨基酸的过程中，有时也有转氨基的反应。（1）氨基化作用氨基化作用指a一酮酸与氨反应形成相应的氨基酸。氨基化作用是微生物同化氨的主要途径。能直接吸收氨合成氨基酸的a一酮酸只有a一酮戊二酸和丙酮酸，如谷氨酸的合成就是a一酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化下，以NAD（P）”为辅酶，通过氨基化反应合成的。此外，延胡索酸和谷氨酸虽不是a一酮酸，但前者可通过双键打开而连接a一氨基，后者则通过酸胺键生成谷氨酸胺，这是一个需ATP的耗能反应。（2）转氨基作用转氨基作用是指在转氨酶催化下，使一种氨基酸的氨基转移给酮酸，形成新的氨基酸的过程。转氨作用普遍存在于各种微生物体内，是氨基酸含成代谢和分解代谢中极为重要的反应。通过转氨基作用，微生物可以消耗一些含量过剩的氨基酸，以得到某些含量较少的氨基酸。（3）前体转化前体转化指20种氨基酸除了可以通过上述途径合成氨基酸以外，还可通过糖代谢的中间产物，如甘油醒一3一磷酸、赤癣糖一4一磷酸、草酸乙酸、3一磷酸核糖焦磷酸等，经一系列的生化反应而合成。根据前体的不同，可将它们分成六组（图5一万）。6．核苷酸的合成核音酸是核酸的基本结构单位，它是由碱基、戊糖、磷酸所组成。根据碱基成分可把核音酸分为源吟核着酸和喀院校青酸。（l）瞟吟核着酸的生物合成瞟吟环几乎是一个原子接着一个原子的合成。它的碳和氮来自氨基酸、O飞和甲酸。它们逐步地添加到核糖磷酸这一起始物质上。微生物合成嫖吟核耷酸有两种方式。一种方式是由各种小分子化合物，全新合成次黄瞟吟核着酸（IMP），然后再转化为其他瞟吟核音酸。次黄瞟吟核耷酸是在核酮糖一5一磷酸的基础上合成的（图5－26）。第二种方式是由自由碱基或校普组成相应的源吟核耷酸。有的微生物无全新合成膜吟核音酸的能力，就以这种方式合成瞟吟核音酸，这是一种补救途径，以便更经济地利用已有成分。（2）喀院核着酸的合成微生物合成喷促校青酸也有两种方式，一种方式是由小分子化合物全新合成尿喀院核耷酸，然后再转化为其他喀陡核青酸；另一种方式是以完整的喀陡或喷喷核耷分子，组成喷唤核着酸（如图5－27）。（3）脱氧核着酸的合成脱氧核耷酸是由核青酸糖基第2位碳上的一一OH还原为H而成，是一个耗能的过程。在不同微生物中，脱氧过程在不同的水平上进行。如在大肠杆菌中，这一过程在核糖核着二磷酸水平上进行，而在赖氏乳酸菌中，这一过程在核糖核青三磷酸上进行。DNA中的胸腺吨院脱氧核着酸是在形成尿喀晚脱氧核糖核音二磷酸后，脱去磷酸，再经甲基化生成的。二、其他耗能反应：运动、运输、生物发光由细菌细胞产能反应形成ATP和质子动力，被消耗在各种途径中。许多能量用于新的细胞组分的生物合成，另外溶质的运动性细胞器的活动、跨膜运输及生物发光也是重要的生物耗能过程。1．运动很多细菌和真核M是可以运动的，一般是靠鞭毛等。在真核微生物中，鞭毛和纤毛均具有ATP酶，水解ATP产生自由能，成为运动所需的动力。目前尚未在细菌鞭毛中发现有ATP酶。细菌鞭毛转动的能量可能来自于细胞内的的质子动力。2．运输目前认为营养物质跨膜运输有四种机制：扩散、促进扩散、主动运输和膜泡运输。其中主动运输和膜泡运输需要消耗能量。3．生物发光许多活的生物体，包括某些细菌、真菌和藻类都能够发光。尽管它们的发光机制不同，但在所有例子中，发光都包含着能量的转移。先形成一种分子的激活态，当这种激活态返回到基态时即发出光来。第三节微生物代谢的调节生命活动的基础在于新陈代谢。微生物细胞内各种代谢反应错综复杂，各个反应过程之间是相互制约，彼此协调的，可随环境条件的变化而迅速改变代谢反应的速度。微生物细胞代谢的调节主要是通过控制酶的作用来实现的，因为任何代谢途径都是一系列酶促反应构成的。微生物细胞的代谢调节主要有两种类型，一类是酶活性调节，调节的是已有酶分子的活性，是在酶化学水平上发生的；另一类是酶合成的调节，调节的是酶分子的合成量，这是在遗传学水平上发生的。在细胞内这两种方式协调进行。本节着重介绍酶活性的调节，有关酶合成的调节参见第九章。一、酶活性调节酶活性调节是指酶通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。这种调节方式可以使微生物细胞对环境变化作出迅速地反应。酶活性调节受多种因素影响，底物的性质和浓度、环境因子，以及其他酶的存在都有可能激活或抑制酶的活性。酶活性调节的方式主要有两种：别构调节和酶分子的修饰调节。1．别构调节调节代谢的别构酶大多数为寡聚酶，一般由两个或两个以上的亚基组成。其中一组亚基称为催化亚基，另一组亚基称为调节亚基。后者与别构效应物结合后可引起酶分子的构象发生改变，从而改变酶的活性。别构效应物主要有底物、产物或代谢途径的最终产物及小分子核着酸类物质等。有的别构效应物可使酶活性增加称为别构激活剂，所发生的效应称为别构激活，有的别构效应物可使酶活性下降称为别构抑制剂，所发生的效应称为别构抑制。细胞可以通过酶的别构效应使酶活性升高或降低以调节其代谢。（综合P114）在某些重要的生化反应中，反应产物的积累往往会抑制催化这个反应的酶的活性，这是由于反应产物与酶的结合抑制了底物与酶活性中心的结合。在一个由多步反应组成的代谢途径中，末端产物通常会反馈抑制该途径的第一个酶，这种酶通常被称为变构酶（allostericenzpo）。例如，合成异亮氨酸的第一个酶是苏氨酸脱氨酶，这种酶被其末端产物异亮氨酸反馈抑制。变构酶通常是某一代谢途径的第一个酶或是催化某一关键反应的酶。细菌细胞内的酵解和三核酸循环的调控也是通过反馈抑制进行的。2．共价修饰调节共价修饰调节是通过共价调节酶来实现的。共价调节酶通过其它酶（修饰酶）对其肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使之处于活性和非活性的互变状态，从而导致调节酶的活化或抑制，以控制代谢的速度和方向。目前已知有多种类型的可逆共价修饰：磷酸化/脱磷酸化；乙酰化/脱乙酰化；腺苷酰化/脱腺苷酰化；尿苷酰化／去尿苷酰化；甲基化／去甲基化；S－S／SH相互转变；ADP核糖基化／去ADP核糖基化等。酶促共价修饰与酶的变构调节不同，酶促共价修饰对酶活性调节是酶分子共价键发生了改变，即酶的一级结构发生了变化。而在变构调节中，酶分子只是单纯的构象变化。在酶分子发生磷酸化等修饰反应时，一般每个亚基消耗一分子ATP，比新合成一个酶分子所耗的能量要少得多。因此，这是一种体内较经济的代谢调节方式。另外，酶促共价修饰对调节信号具放大效应，其催化效率比变构酶调节要高。二、分支合成途径调节不分支的生物合成途径中的第一个酶受末端产物的抑制，而在有两种或两种以上的末端产物的分支代谢途径中，调节方式较为复杂。其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶，同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用，分支代谢的反馈调节方式有多种。1．同工酶同工酶（isoenzmpe）是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。其特点是：在分支途径中的第一个酶有几种结构不同的一组同工酶，每一种代谢终产物只对一种同工酶具有反馈抑制作用，只有当几种终产物同时过量时，才能完全阻止反应的进行。这种调节方式的典型例子是大肠杆菌天门冬氨酸族氨基酸的合成。有三个天门冬氨酸激酶催化途径的第一个反应，分别受赖氨酸、苏氨酸、甲硫自酸的调节。2．协同反馈抑制在分支代谢途径中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用。若某一末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用。例如，在多粘芽抱杆菌合成赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸的途径中，终产物苏氨酸和赖氨酸协同抑制天门冬氨酸激酶。3．累积反馈抑制在分支代谢途径中，任何一种末端产物过量时都能对共同途径中的第一个酶起抑制作用，而且各种末端产物的抑制作用互不干扰。当各种末端产物同时过量时，它们的抑制作用是累加以。如果末端产物H单独过量时，抑制AB酶活性的40％，剩余酶活性为60％，如果末端产物Z单独过量时抑制AB酶活性的30％，当HZ同时过量时，其抑制活性为：40％十门一40％）x30％＝58％。累积反馈抑制最早是在大肠杆菌的谷氨酸胺合成酶的调节过程中发现的，该酶受8个最终产物的积累反馈抑制。8个最终产物同时过量时，酶活力完全被抑制。4．顺序反馈抑制分支代谢途径中的两个末端产物，不能直接抑制代谢途径中的第一个酶，而是分别抑制分支点后的反应步骤，造成分支点上中间产物的积累，这种高浓度的中间产物再反馈抑制第一个酶的活性。因此，只有当两个末端产物都过量时，才能对途径中的第一个酶起到抑制作用（图5－29d）。枯草芽抱杆菌合成芳香族氨基酸的代谢途径就采取这种方式进行调节。第四节微生物次级代谢与次级代谢产物一、次级代谢与次级代谢产物一般将微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程，称为初级代谢。次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。这一过程的产物，即为次级代谢产物。有人把超出生理需求的过量初级代谢产物也看作是次级代谢产物。次级代谢产物大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素等类型。次级代谢与初级代谢关系密切，初级代谢的关键性中间产物往往是次级代谢的前体，比如糖降解过程中的乙酰一COA是合成四环素、红霉素的前体；次级代谢一般在菌体对数生长后期或稳定期间进行，但会受到环境条件的影响；质粒与次级代谢的关系密切，控制着多种抗生素的合成。次级代谢不像初级代谢那样有明确的生理功能，因为次级代谢途径即使被阻断，也不会影响菌体生长繁殖。关于次级代谢的生理功能，目前尚无一致的看法。二、次级代谢的调节1．初级代谢对次级代谢的调节次级代谢与初级代谢类似，它在调节过程中也有酶活性的激活和抑制及酶合成的诱导和阻遏。由于次级代谢一般以初级代谢产物为前体，因此次级代谢必然会受到初级代谢的调节。例如青霉素的合成会受到赖氨酸的强烈抑制，而赖氨酸含成的前体a一氨基己二酸可以缓解赖氨酸的抑制作用，并能刺激青霉素的合成。这是因为。一氨基己二酸是合成青霉素和赖氨酸的共同前体。如果赖氨酸过量，它就会抑制这个反应途径中的第一个酶，减少a一氨基己二酸的产量，从而进一步影响青霉素的合成。2．碳、氮代谢物的调节作用次级代谢产物一般在菌体对数生长后期或稳定期间合成，这是因为在菌体生长阶段，被快速利用的碳源的分解物阻遏了次级代谢酶系的合成。因此，只有在对数后期或稳定期，这类碳源被消耗完之后，解除阻遏作用，次级代谢产物才能得以合成。高浓度的NH4可以降低谷氨酸胺合成酶的活性，而后者的比活力与抗生素的合成呈正相关性，因此高浓度的NH4对抗生素的生产有不利影响。而另一种含氮化合物——硝酸盐却可以大幅度地促进利福霉素的合成，因其可以促进糖代谢和TCA循环酶系的活力，以及琥珀酰一CbA转化为甲基丙二酿一CbA的酶活力，从而为利福霉素的合成提供了更多的前体，同时它可以抑制脂肪合成，使部分用于合成脂肪的前体乙酸一CbA转为合成利福霉素脂肪环的前体，另外硝酸盐还可提高菌体中谷氨酸胺合成酶的比活力。3．诱导作用及产物的反馈抑制在次级代谢中也存在着诱导作用，例如，巴比安虽不是利福霉素的前体，也不掺入利福霉素，但能促进将利福霉素SV转化为利福霉素B的能力，这里巴比妥便起诱导作用。同时，次级代谢产物的过量积累也能像初级代谢那样，反馈抑制其合成酶系。