人游离血红蛋白(f-Hb)ELISA试剂盒说明书
本试剂盒仅供研究使用
预期应用
ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关液体中游离血红蛋白(f-Hb)含量。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中f-Hb水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入f-Hb抗原、生物素化的抗人f-Hb抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的f-Hb呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1.酶联板：一块(96孔)
2.标准品(冻干品)：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200ng/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.12ng/ml，1.56ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0ng/ml，临用前15分钟内配制。
如配制100ng/ml标准品：取0.5ml200ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3.样品稀释液：1×20ml/瓶。
4.检测稀释液A：1×10ml/瓶。
5.检测稀释液B：1×10ml/瓶。
6.检测溶液A：1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
7.检测溶液B：1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。
8.底物溶液：1×10ml/瓶。
9.浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10.终止液：1×10ml/瓶(2NH2SO4)。
标本的采集及保存
1.细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。
2.血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
3.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C1000xg离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100ul(取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37℃,60分钟。
3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
4.每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液)100ul，37℃，60分钟。
5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
6.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。
7.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15分钟以内进行检测。
注：
1.每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
2.为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。
3.未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。
4.建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水
纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需
要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的人f-Hb，且与其它相关蛋白无交叉反应。
计算
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标)，OD值为纵坐标(普通坐标)，在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1.洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
2.一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
3.请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
4.如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。
5.在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
6.底物请避光保存。
检测范围：
1.56ng/ml-100ng/ml
说明
1.试剂盒保存：-20℃(较长时间不用时)；2-8℃(频繁使用时)。
2.有效期：6个月
3.浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
4.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
5.中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。