二手高效液相色谱仪检测利巴韦林
1前言我们对二手高效液相色谱仪检测利巴韦林离子交换柱进行了可行性实验，试验结果显示：离子交换柱使用方便，色谱柱的再生也比较简单，色谱图峰形对称性好，且杂质的分离度明显优于C18柱。用此种方法对利巴韦林及其十余种制剂进行了含量及有关物质的测定，均获得了满意的结果。利巴韦林及其系列制剂为广谱抗病毒药，其原料药质量标准收载于中国药典2000年版二部，含量测定用反相二手高效液相仪法，采用C18色谱柱，流动相为水或0.03mol/L硫酸溶液，测定波长为207nm。利巴韦林制剂共有10个品种，其含量测定除两个品种采用定氮法外，其余均采用高效液相法，所使用的条件与原料药相同。但是二手高效液相色谱仪检测利巴韦林测定利巴韦林测定所使用的流动相中未加甲醇一类的有机相，具有不可调节，选择性差等缺点；同时在做有关物质测定时，杂质与主峰的分离度不好，特别是注射液中含有氯化钠时，其结果是，C18柱的柱压不断增高，而柱效却在不断降低。
2实验部分
2.1试剂和仪器
二手高效液相色谱仪检测利巴韦林Waters2695高效液相色谱仪，Waters2996二极管阵列检测器，Empower工作站软件
二手高效液相色谱仪检测利巴韦林，利巴韦林对照品，由中国生物制品检定所提供，批号为629-200202。水：二次重蒸过滤水。硫酸：分析纯。
2.2二手高效液相色谱仪检测利巴韦林：色谱操作条件
色谱柱为氢型强阳离子交换树脂，磺化交联的苯乙烯二乙烯苯共聚物的离子交换柱（型号LZDSL17，北京龙智达公司提供），7.8mm×100mm。流动相为水（用稀硫酸调节PH2.5±0.1）；检测波长207nm；灵敏度为0.01（AUFS）。在此条件下，样品与杂质可实现基线分离。
以上操作参数是典型的，可以根据不同仪器特点，对给定操作参数做适当调整，以期获得最佳效果，在上述操作条件下，利巴韦林测定的典型高效液相色谱图如图1所示。
2.3测定步骤
2.3.1标样溶液的配制
二手高效液相色谱仪检测利巴韦林：取利巴韦林对照品约25mg（精确至0.0002g），置25ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取3.0置于50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，备用。
2.3.2样品溶液的配制
二手高效液相色谱仪检测利巴韦林：称取利巴韦林样品25mg（精确至0.0002g）于25mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取3.0置于50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，备用。
图1利巴韦林HPLC测定典型色谱图
图2利巴韦林HPLC测定典型色谱图（前面小峰为氯化钠）
2.3.3测定
在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，计算相对响应值变化小于1.0%，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。
按外标法公式进行计算。
3结果与讨论
3.1最佳操作条件的选择
取利巴韦林对照品，加流动相制成约25μg/ml的溶液，在200-300的波长范围内进行扫描，利巴韦林在207nm波长处有最大吸收，故测定波长仍确定为207nm。
为确保样品与杂质的完全分离，且分析周期短，分析成本低，经过多次实验表明，当流动相为水（用稀硫酸调节PH2.5±0.1）时能满足上述要求，基线平稳且峰型对称，与其它杂质峰没有重叠，得到了较好的分离效果。
3.2分析方法线性相关性的测定
取利巴韦林对照品约25mg，精密称量，置25ml容量瓶中，二手高效液相色谱仪检测利巴韦林：加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml置于50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，分别吸取上述溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以利巴韦林浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程为A=1894C+1755，相关系数r=0.9998。结果表明利巴韦林在30-70μg/ml范围内呈良好线性关系。
3.3方法的精密度和准确度
平行称取试样5份，按上述色谱条件测得利巴韦林标准偏差为0.44；在已知含量的利巴韦林样品中加入一定数量的标准品溶液，测得利巴韦林的平均回收率为99.72%，说明该方法准确度良好。
3.4有关物质检测条件的方法及验证
3.4.1最低检出量
将利巴韦林对照品溶液，逐步稀释，在上述色谱条件下经验20μl，以基线信号峰3倍峰高为最低检出限，二手高效液相色谱仪检测利巴韦林：测得利巴韦林的最低检出量为0.3ng。
3.4.2拖尾因子及分离度实验
取利巴韦林原料，制成0.4mg/ml的溶液，并加入已知杂质马嘌呤，在上述色谱条件下测定，记录色谱图，计算拖尾因子及分离度，拖尾因子为1.0，利巴韦林主峰和各杂质峰之间的分离度大于5，均符合中国药典2000年版的规定。
方法名称：利巴韦林口服溶液－利巴韦林－高效液相色谱法
应用范围：本方法采用高效液相色谱法测定利巴韦林原料药中利巴韦林的含量。
本方法适用于利巴韦林原料药。
方法原理：供试品经水稀释，二手高效液相色谱仪检测利巴韦林：进入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，于波长207nm处检测利巴韦林的峰面积，计算出其含量。
试剂：水
仪器设备：1.仪器
1.1高效液相色谱仪
1.2色谱柱
十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论塔板数按利巴韦林峰计算应不低于2500。
1.3紫外吸收检测器
2.色谱条件
2.1流动相：水
2.2检测波长：207nm
2.3柱温：室温
试样制备：1.对照品溶液的制备
精密称取利巴韦林对照品适量，加水稀释制成每1mL中约含30µg的溶液，即为对照品溶液。
2.供试品溶液的制备
精密称取供试品适量（约相当于利巴韦林150mg），加水稀释成每1mL中约含利巴韦林30µg的溶液，即为供试品溶液。
注：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一。“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。
操作步骤：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20mL，注入高效液相色谱仪，用紫外吸收检测器于波长207nm处测定利巴韦林（C8H12N4O5）的峰面积，计算出其含量。