373A型DNA测序仪的原理

  仪器信息网 ·  2012-09-18 09:34  ·  35534 次点击
373A型DNA测序仪的原理
DNA序列测定是分子生物学领域最重要的技术之一,是了解基因结构和功能的基础。DNA测序技术的不断完善和仪器自动化程度的不断提高,为大型基因组测序奠定了基础,当今大多数蛋白质序列都是通过基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。DNA测序方法主要有双脱氧链终止法(Sanger法)和化学降解法(Maxam-Gilbert法)。目前不管是传统的手工测序法,还是仪器自动测序法均使用前者,而仪器自动测序法以其快速、准确等优点得以广泛应用。我室于1995年,引进美国PE公司的373A型DNA序列测定仪,仪器专管共用,两年来为校内、外科研人员提供测序服务,现将该仪器使用中的一点体会报告如下。
373A型DNA测序仪的原理
1、测序原理和特点
373A型DNA测序仪使用双脱氧链终止法(Dye-primer或Dye-terminator)进行DNA测序反应,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,实时检测自动读序。该仪器与其它仪器相比较,其显著特点是它能用4种不同的荧光分子分别标记4种反应引物(Dye-primer法)或4种dNTP(Dye-terminator法)。4个反应分开进行,产物合并在一个泳道中电泳分离,根据每条区带的荧光不同加以识别读序,这样不但可提高每次分析样品的数量(373A型每次可测定36个样品),又克服了泳道间差异造成的读序误差。与传统的手工测序比较:①安全,无污染;用荧光素代替同位素,避免了放射性同位素的污染和对人体的危害;②模板用量大大减小,单链DNA模板用量为0.4μg,双链DNA质粒模板用量为0.8μg,PCR产物用量为5ng~20ng;③测序长度大大提高,一般可达450bp~500bp。
373A型DNA测序仪的原理
2、体会
2.1模板纯化是前提DNA测序所用的模板可以是质粒DNA,也可以是PCR产物,但使用高质量的模板是测序成功的前提。DNA纯化的方法很多,如聚乙二醇沉淀法、琼脂糖凝胶电泳法、氯化铯梯度离心法、高效液相色谱法(HPLC法)和一次性微柱法等。用这些方法纯化的DNA都可用于DNA测序,但从我们实验结果来看,HPLC法和微柱法(如Promega公司的WizardPlusMiniprepDNAPurificationSystem)效果最好。为了保证测序的成功率,测序模板纯化后,必须先进行1%琼脂糖凝胶电泳(凝胶中含0.5mg/L溴化乙锭,样品浓度为0.2g/L,上样量为1μl)鉴定其纯度,要求条带清晰,无杂带,无拖尾,否则应重新纯化,以保证测序的结果。
2.2测序反应是关键测序反应是DNA自动测序的第一步,也是测序成败的关键所在。符合测序要求的DNA模板,经过测序反应后,会形成数百条带有不同荧光的核苷酸链,且每条核苷酸链的碱基数只相差1个碱基。目前,我们使用的测序试剂为PE公司提供的DNA测序试剂盒(Dye-primer或Dye-ter-minator),其中每种试剂的浓度为产品的最佳组合,而且测序反应的条件(变性、退火、延伸的时间和温度)与试剂盒配套使用。这就必须按照试剂盒的要求控制好模板的浓度,即使纯度合格的DNA模板其浓度也很重要,单链DNA模板为0.10g/L,双链质粒模板为0.20g/L,PCR产物根据其片段的长度取适当的量,浓度过高或过低都会直接影响测序的结果。根据我们的使用情况,浓度太高时,电泳条带信号强,会出现平头峰,测序结果短(一般<250bp),而且误差大;浓度过低时,电泳条带信号弱,噪声多,误差大,可信度差。在使用Dye-termina-tor法测序时(一般模板为PCR产物),除模板的纯度和浓度符合要求外,所用引物的纯度和浓度也很重要,引物应为测序级纯度,浓度应准确定量。
2.3电泳条件是保证前面已提到,测序反应产物经电泳分离后,实时进行自动读序,要使只差1个碱基的DNA链达到最佳分离,电泳的条件至关重要。373A型DNA测序仪使用的是尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶浓度为4.75%,恒功率(30W),这些条件相对固定,所以电泳的成败主要取决于凝胶的配制。一是电泳试剂的纯度。由于该系统是检测荧光信号,所以要求试剂不能含有杂质,我们使用Sigma公司的试剂和部分国产分析纯试剂,经实验证实可以达到实验的要求。二是凝胶配制。要求各种试剂的称量要准确,除凝胶浓度准确外,TBE缓冲液的配制尤为重要,否则会影响电泳结果,造成测序失败,这是由于TBE的离子浓度的高低可直接引起电泳时电压的升高或降低。三是灌胶要仔细。要防止产生气泡、波浪纹等而影响电泳分离。
总之,在使用全自动DNA测序仪时,模板的纯度和浓度、测序反应、电泳分离等环节都会影响测序的结果,任何一个环节出现问题,都会造成前功尽弃。根据我们的经验,在测序试剂盒质量有保证、仪器工作正常、实验人员精心操作的前提下,测序模板的纯度和浓度是测序成功的关键,测序失败往往是由于模板的纯度不够或浓度不准所致。两年来中我们测定了数百份样品,成功率达到88%。其中Dye-primer法测定的样品占95%,单链DNA模板单向测序可达700bp~800bp,双链质粒模板单向测序可达500bp~600bp

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